益腎通癃膠囊對良性前列腺增生大鼠模型COX-2 及PGE2 表達的影響

周 歡，羊 羨，李 博，趙文雪，羅星樂，張 彪，苗潤澤，胡 偉，涂雅玲，陳其華

（1．湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙410208； 2．湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007）

良性前列腺增生癥（Benign prostatic hyperplasia，BPH）是中老年男性常見的泌尿系統疾病之一，該病進展緩慢，主要以下尿路癥狀為主，如尿頻、尿急、排尿困難及夜尿次數增多等排尿前癥狀，尿等待、尿線變細、排尿無力等排尿期癥狀以及排尿不盡、尿后滴瀝等排尿后癥狀，嚴重影響患者生活質量。因此，對BPH 的積極防治和改善患者的生活質量均具有重要意義。BPH 發病機制目前尚不明確，近年來炎癥在BPH 的發生和發展過程中的重要作用已逐漸引起關注［1-4］。有研究證實，與環氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）相關聯的炎癥系統參與了BPH 的發生與發展［5-6］，并與前列腺癌的發病密切相關［7］。故從COX-2 及相關通路入手，探討BPH 的發病機制及干預方法，將病變控制在BPH 初期階段甚至徹底治愈具有重要的臨床價值。導師陳其華教授在臨床研究中發現，經驗方益腎通癃膠囊對BPH 有較好的治療效果。本實驗通過觀察益腎通癃膠囊對BPH 模型大鼠前列腺組織內COX-2 及PGE2表達的影響，探究其治療良性前列腺增生的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性SPF 級SD 大鼠80 只，體質量（250±20）g，8 周齡，由湖南斯萊克景達實驗動物有限責任公司提供，實驗動物生產許可證：SCXK（湘）2014-0002。飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗中心，實驗前將動物適應性馴養1 周。本研究所有動物實驗經湖南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準。

1.1.2 實驗試劑 益腎通癃膠囊（湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心生產，生產批號201306060）；塞來昔布膠囊［Pfizer Pharmaceuticals LLC/輝瑞制藥有限公司分裝（英國/中國分裝），進口藥品注冊標準JX20000001，國藥準字J20120063］；癃閉舒膠囊（石家莊科迪藥業有限公司，國藥準字Z10960007）；丙酸睪丸酮注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批號1104161，規格25 mg/mL/支×10 支/盒），使用時溶于橄欖油中；橄欖油（西班牙生產，規格500 mL/瓶），作為丙酸睪丸酮的溶媒；RNA 提取液

trizo（lInvitrogen，貨號15596018）；PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（TAKARA，RR036A）；SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（TAKARA，RR820A）；COX-2 及PGE2引物由生

工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 實驗儀器 電子分析天平；臺式高速冷凍型微量離心機（Eppendorf，5424R）；熒光定量PCR儀（ABI，7500）；超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設備有限公司，儀器型號SW-CJ-1FD）；超微量分光光度計（Thermo，Nano Drop2000）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥 將80 只雄性SPF 級SD 大鼠適應性喂養1 周后隨機分為8 組，每組10 只，分別為空白組、假手術組、模型組、癃閉舒組、塞來昔布組，益腎通癃低、中、高劑量組。空白組不做任何處理，假手術組切除雙側睪丸，其余各組采用雙側睪丸切除術聯合經背皮下注射丙酸睪酮復制BPH 大鼠模型。造模成功后，空白組、假手術組及模型組予生理鹽水10 mL/（kg·d）灌胃，癃閉舒組予癃閉舒溶液0.24 g/（kg·d）灌胃，塞來昔布組予塞來昔布溶液0.02 g/（kg·d）灌胃，益腎通癃低、中、高劑量組分別予益腎通癃溶液0.24 g/（kg·d）、0.48 g/（kg·d）、0.96 g/（kg·d）灌胃。連續灌胃12周。

1.2.2 檢測指標

1.2.2.1 前列腺濕重及前列腺指數（PI） 末次給藥24 h 后（禁食不禁水12 h），大鼠稱重后迅速脫頸椎處死，剖腹仔細分離后摘取前列腺，去除附帶的結締組織，用濾紙吸干前列腺組織表面的液體，隨后稱取濕重，計算PI。PI=前列腺濕重（mg）/小鼠體質量（g）。

1.2.2.2 COX-2 及PGE2mRNA 表達 取勻漿管，加入1 mL 的Trizol Reagent，置冰上預冷，取100 mg組織，加入勻漿管中，充分研磨直至無可見組織塊，12 000 rpm 離心10 min 取上清，加入250 μL三氯甲烷，顛倒離心管15 s，充分混勻，靜置3 min，4 ℃下12 000 rpm 離心10 min，將上清轉移至新的離心管中，加入0.8 倍體積的異丙醇，顛倒混勻，-20 ℃放置15 min，4 ℃下12 000 rpm 離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA。吸除液體，加入75%乙醇1.5 mL 洗滌沉淀，4 ℃下12 000 rpm離心5 min，將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺上吹3 min，加入15 μL 無RNA 酶的水溶解RNA，55 ℃孵育5 min。用逆轉錄試劑盒將總mRNA 逆轉錄為cDNA 后進行擴增，PCR 儀的反應條件為95 ℃，10 min，95 ℃，15 s→60 ℃，60 s，反應共進行40 個循環，于65 ℃～95 ℃繪制溶解曲線。

1.2.2.3 前列腺組織炎癥浸潤情況 取前列腺組織固定于10%多聚甲醛溶液中，予常規乙醇脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色，在光鏡下觀察各組大鼠前列腺組織內炎癥浸潤情況。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統計學處理，所有數據均以均數±標準差（±s）表示，組間比較若滿足正態性且方差齊時采用單因素方差分析，采用LSD法和SNK法，方差不齊時選擇Tamhane T2和Dunnett T3法進行方差檢驗和兩兩比較，若不滿足正態性時采用秩和檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠前列腺濕重與PI 值比較

假手術組大鼠前列腺濕重及PI 值與空白組比較差異無統計學意義（P＞0.05），其余組別大鼠前列腺濕重及PI 值均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，癃閉舒組、塞來昔布組、益腎通癃低、中、高劑量組大鼠前列腺濕重及PI 值均明顯降低（P＜0.05），尤以塞來昔布組及益腎通癃中劑量組降低最顯著（P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠前列腺濕重及PI 值比較 （x±s）

2.2 各組大鼠前列腺組織中COX-2 及PGE2 mRNA表達的比較

與空白組比較，假手術組大鼠前列腺組織COX-2、PGE2mRNA 表達差異無統計學意義（P＞0.05），其余組別大鼠前列腺組織COX-2、PGE2mRNA 表達均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，癃閉舒組、塞來昔布組、益腎通癃低、中、高劑量組大鼠前列腺組織COX-2、PGE2mRNA 表達均明顯降低（P＜0.05），尤以塞來昔布組及益腎通癃中劑量組降低最顯著（P＜0.01）。結果見表2 及圖1。

表2 各組大鼠前列腺組織中COX-2 及PGE2 mRNA 表達比較（x±s）

2.3 各組大鼠前列腺組織炎癥浸潤情況比較

空白對照組及假手術組大鼠前列腺組織內未見有明顯炎性細胞浸潤；模型組大鼠前列腺組織內可見大量炎癥細胞浸潤；癃閉舒組、益腎通癃低劑量組及高劑量組大鼠前列腺組織內可見部分炎癥細胞浸潤；塞來昔布組及益腎通癃中劑量組大鼠前列腺組織內可見少量炎癥細胞浸潤。結果見圖2。

3 討 論

圖1 各組大鼠前列腺組織中COX-2 及PGE2 mRNA 表達

BPH 屬中醫“精癃”“癃閉”范疇。《靈樞·本輸》：“三焦者，……實則閉癃，虛則遺溺，遺溺則補之，閉癃則瀉之。”多數醫家認為BPH 以本虛標實為總的病機，本虛以腎虛、脾虛為主，標實則以痰濁、瘀血居多［8-9］。本病多見于中老年男性患者，病位在精室。脾腎虧虛，命門火衰，下元虛寒，氣化不足，開合失司則致癃閉；久病多瘀，氣虛推動無力，氣滯血行不利，日久則成瘀，結于下焦，故腎虛血瘀是其主要病機。益腎通癃膠囊方中補骨脂、黃芪共為君藥，以補腎益氣；五靈脂活血散瘀；山藥、山茱萸、熟地、枸杞子滋補腎陰，寓陽中有陰，陰中有陽之意；金櫻子固精縮尿；茯苓健脾；甘草調和諸藥。全方共奏補腎益氣，化瘀縮尿之功效，目前已在臨床使用中獲得較好療效［10］。

圖2 各組大鼠前列腺組織炎癥浸潤情況

近年來，關于炎癥與BPH 發病的研究日趨增多［11-13］，慢性炎癥反應作為BPH 疾病進程中的主要致病因素已經得到了證實，有學者研究發現BPH 樣本在組織學檢查中均顯示有炎癥細胞浸潤［14］。COX-2 是一種誘導型酶，目前已被證實是慢性炎癥發生的關鍵成員，生理狀態下其在絕大部分組織細胞中均不表達，當細胞受到炎性介質、細胞因子、生長因子、癌基因產物或致癌劑等因素刺激作用時，在細胞內呈表達增高趨勢，參與多種病理生理過程。有研究證實，與COX-2 相關聯的炎癥系統參與了BPH 的發生與發展［15］，部分藥物對BPH 的治療是通過抑制COX-2 及相關炎癥蛋白的表達而實現［16-17］。PGE2在機體內分布廣泛，通過與下游的4 種受體結合，激活了眾多具有增生、凋亡、遷移、血管新生作用的通路，是許多增生性疾病乃至癌癥重要始動和轉移環節［18］。有研究表明，PGE2的表達水平與前列腺體積呈正相關，同時PGE2含量與炎癥的嚴重程度密切相關［19］。

本實驗通過雙側睪丸切除術聯合經背皮下注射丙酸睪酮復制前列腺增生大鼠模型，造模成功后探究不同藥物對模型大鼠前列腺組織內COX-2 及PGE2的影響。研究結果表明，益腎通癃膠囊可明顯降低良性前列腺增生大鼠前列腺組織的前列腺濕重及前列腺指數，下調COX-2 及PGE2表達，減輕前列腺組織的局部炎癥浸潤情況。綜上所述，益腎通癃膠囊對前列腺增生大鼠模型炎癥反應具有很好的改善作用，其機制可能與抑制COX-2 及PGE2受體表達水平有關，益腎通癃膠囊在前列腺增生患者治療中的作用及其良好的抗炎作用得到充分證實，為進一步研究開發提供了一定的支持。