清香型白酒酒醅乳酸菌分離鑒定及其自溶特性研究

李智琪 - 史 瑛 王萌萌 - 毛 健 張秀紅 -

(1.山西師范大學生命科學學院，山西 臨汾 041004；2.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214000；3.山西師范大學食品科學學院，山西 臨汾 041004)

大曲是白酒釀造的糖化發酵生香劑，除含有產生淀粉酶的霉菌、合成酒精的酵母菌外，還含有大量的細菌，如芽孢桿菌和乳酸菌等。酒醅發酵過程中，除兼性厭氧的酵母菌能快速生長繁殖將還原糖轉化為酒精外，厭氧環境還促進了耐氧乳酸菌的大量生長。不同香型酒醅中均檢測出含有大量的乳酸菌，陳申習等[1]從清香型小曲酒機械化釀造車間發酵過程中的酒醅中分離得到51株乳酸菌，經形態觀察和16S rDNA鑒定為5株干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、10株短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、8株希式乳桿菌(Lactobacillushilgardii)、28株瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)。杜海等[2]從芝麻香型白酒酒醅中分離篩選出32株乳酸菌，經16S rDNA鑒定為7個種，分別為副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、玉米乳桿菌(Lactobacilluszeae)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidipiscis)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilacti)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceu)。乳酸菌在白酒釀造過程中起重要作用，一方面是乳酸菌代謝產生的乳酸是白酒主要的風味物質，在白酒微量成分中占有很大比例，乳酸能起到調和酒味的作用，掩蓋酒精的刺激性，還能與多種成分相互親合，使酒體協調柔和，包括乳酸在內的有機酸含量直接影響白酒的品質[3]；另一方面是乳酸與乙醇酯化合成乳酸乙酯，與乙酸乙酯共同組成清香白酒的主體香氣成分[4]。但是，隨著氣溫的回升，酒醅乳酸菌過量生長，酒醅酸度過高，產酒量降低，同時乳酸乙酯隨之升高，影響了基酒質量[5]。目前，酒醅乳酸菌的生長控制仍缺乏有效手段。

乳酸菌在一定條件下能釋放自溶酶水解細胞壁的主要成分肽聚糖，導致細胞裂解自溶。不同乳酸菌菌株自溶度不同，影響自溶度的因素也較多[6]。關于乳酸菌自溶度的研究主要集中于發酵乳制品發酵劑乳酸菌的研究[7-8]。長期厭氧高酸、高醇釀酒環境對酒醅乳酸菌自溶度的研究尚未見報道。試驗擬從清香酒醅中分離乳酸菌，考察其自溶特性，為白酒發酵過程中乳酸菌的控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

清香型酒醅：某清香型白酒企業；

MRS培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、磷酸氫二鉀2 g、酵母粉5 g、檸檬酸氫二銨2 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、吐溫80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、蒸餾水1 000 mL，固體培養基加瓊脂15～20 g，碳酸鈣15 g，121 ℃滅菌20 min，青島海博生物技術有限公司；

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、麥芽浸粉：生物試劑，青島海博生物技術有限公司；

其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

PCR反應試劑、DNA Marker：北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

臺式高速冷凍離心機：5810R型，德國Eppendorf公司；

雙光速紫外—可見分光光度計：A560型，翱藝儀器(上海)有限公司；

PCR儀：ProFlexTMBase型，賽默飛科技有限公司；

pH計：FE20型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ-LS-50SII型，上海博訊實業有限公司；

電子分析天平：FA2004N型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

隔水式恒溫培養箱：YHZ-98AB型，上海森信實驗儀器有限公司；

凝膠成像儀：Universal Hood II型，美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 清香酒醅乳酸菌的分離純化 取酸度分別為1.54，1.25，1.16，0.90 mmol/10 g的酒醅各25 g溶解于225 mL無菌生理鹽水中，充分混勻，兩層無菌紗布過濾。無菌條件下用無菌生理鹽水稀釋成濃度為10-1～10-77個梯度的樣液，每個梯度3個平行，選取10-5，10-6，10-7稀釋度的稀釋液1 mL于無菌培養皿中，用MRS-碳酸鈣培養基澆注，凝固后，置于37 ℃恒溫培養箱中培養48 h。挑取平板上有明顯溶鈣圈的單菌落進行多次劃線、分離純化。并將得到的單菌落進行革蘭氏染色、鏡檢和過氧化氫試驗，選擇革蘭氏染色陽性且過氧化氫酶陰性的菌株初步判斷為乳酸菌[9-12]。并用甘油管冷凍保藏法-80 ℃保藏備用。

1.2.2 清香酒醅乳酸菌的分子生物學鑒定 使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法對菌株基因組DNA進行提取[13-14]。16S rDNA擴增引物采用細菌通用引物：正向引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR擴增體系為：2×Taq PCR MasterMix 25 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，模板1 μL，補充去離子水至50 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環，72 ℃延伸10 min，16 ℃保溫。擴增反應完畢后，取PCR產物與6×Loading Buffer混合，加樣于1.0%的瓊脂糖凝膠點樣孔中，上機電泳，電泳液為1×TBE，溴化乙錠(EB)染色30 min，電泳結束后將膠板置于凝膠成像系統中觀察。若PCR擴增成功，則會在1 500 bp處見到條帶并拍照，送至上海生物工程有限責任公司進行測序。

乳酸菌16S rDNA序列分析：將測序得到的乳酸菌16S rDNA序列在NCBI上遞交Blast進行同源性分析，并從GenBank數據庫中下載與待分析序列相近的公開發表菌株的16S rDNA序列[15-16]。

1.2.3 乳酸菌自溶度檢測

(1)菌體培養及處理：活化后菌株培養至對數生長期(OD650 nm為0.9～1.0)后，以4%的接種量接種于MRS液體培養基，37 ℃培養至目標菌體濃度，于4 ℃，5 000 r/min離心10 min，收集菌體。無菌水洗滌兩次菌體，然后用PBS(50 mmol/L，pH 6.5)緩沖液重懸，備用。調整菌液吸光值OD650 nm為1.0左右。

(2)自溶度檢測方法：將收集的待測菌體細胞懸浮，收集菌體于PBS(50 mmol/L，pH 6.5)緩沖液中，調整菌液吸光值OD650 nm為1.0左右。測定初始OD650 nm。其余上述菌懸液置于培養箱溫育24 h，測定OD650 nm。按式(1)計算菌株自溶度[17]。

(1)

式中：

R——自溶度，%；

A0——初始OD650 nm值；

At——24 h后測定的OD650 nm值。

1.2.4 溫度對菌株自溶度的影響 取對數生長期的菌體細胞，重懸于pH 6.5的PBS緩沖液(50 mmol/L)中，分別置于15，20，25，50 ℃下溫育24 h，測定其自溶度。

1.2.5 pH對菌株自溶度的影響 洗滌菌體分別重懸于pH為3.5，4.0，4.5，5.0的PBS緩沖液(50 mmol/L)中，于37 ℃溫育24 h，測定其自溶度。

1.2.6 數據處理 各項指標重復測定3次，運用Excel進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 清香型白酒酒醅乳酸菌的分離、純化

用MRS-碳酸鈣培養基從清香酒醅中分離純化出47個單菌株，菌落呈圓形，直徑為0.5～3.0 mm，米黃色或白色，不透明或半透明，表面濕潤光滑，凸起，革蘭氏染色陽性，不運動、不產生孢子，過氧化氫酶陰性，可初步確定為乳酸菌。部分菌株的菌落特征及顯微特征見圖1、2。

圖1 部分乳酸菌菌株的菌落特征

圖2 部分乳酸菌菌株顯微特征

2.2 清香型白酒酒醅乳酸菌菌株的16S rDNA鑒定

由表1可知，與短乳桿菌屬(L.brevis)親緣關系最近的菌株有SL61-1、SL61、SL21、YP49-1、YP62、MC50、SL31、YP37-1、SL63、LMM40、LMM87-1、YP38-1、MC90、YP31-1、MC55-1、SL33-1、YP49、YP37-2、MC46、MC46-2；與布氏乳桿菌屬(L.buchneri)親緣關系最近的菌株有SL45、SL58、SL63-2、SL28、YP15-2、SL7-1、YP8；與植物乳桿菌屬(L.plantarum)親緣關系最近的菌株為YP15-1、SL18、YP37、SL18、YP37、LMM23、MC30-2、SL25-1、MC50-1、YP82-3、SL58-1、SL63-1、LB36、LMM3-3、LB60、LB1-1、MC29、LMM3-5；與戊糖乳桿菌屬(L.pentosus)親緣關系最近的菌株有YP24、LB27、SL33、SL44-1。

表1 47株乳酸菌 16S rDNA 序列 Blast 比對結果

2.3 清香型白酒酒醅乳酸菌的自溶度

張玉玉等[18]研究發現對數生長期菌體的自溶度最高，因此試驗選取對數生長中期的菌體測定自溶度。由表2可知，MC46株、MC30-2株的自溶度最高，分別達29.27%，26.62%；SL58株、LMM40株、YP82-3株、YP62株的自溶度最低。L.brevis中，除自溶度最高的L.brevisMC46外，L.brevisLMM40的自溶度僅為5.03%；L.buchneriSL7-1的自溶度達17.29%，L.buchneriYP15-2和L.buchneriSL45的自溶度分別為10.78%，10.51%，L.buchneriSL58的自溶度為5.01%，與張玉玉等[18]的結果類似。

表2 對數生長中期菌株的自溶度

2.4 溫度對清香型白酒酒醅乳酸菌自溶度的影響

由圖3可知，大部分菌株15 ℃時的自溶度最低，隨溫度的升高自溶度增大，當溫度為37 ℃時，自溶度達到最高。而菌株L.brevisMC46-2在30 ℃時的自溶度最大，達29.18%；菌株L.plantarumMC30-2在低溫環境下也表現出較高的自溶度，從25 ℃升溫至37 ℃時，自溶度增幅僅為1.66%。

圖3 溫度對乳酸菌自溶度的影響

圖4 pH對乳酸菌自溶度的影響

2.5 pH對清香型白酒酒醅乳酸菌自溶度的影響

由圖4可知，菌體自溶與環境pH值密切相關。當pH為3.5時，各菌株自溶度僅為2.65%～6.96%；當pH為3.5～6.5時，菌株的自溶度隨pH的增大而增大；當pH為6.5時，各菌株的自溶度增加到20.97%～29.27%。而菌株L.brevisYP49-1在較低的pH下表現出活躍的自溶狀態，與Riepe等[19]的研究結果一致。

3 結論

試驗表明，從清香型白酒——汾酒酒醅中篩選出的47株乳酸菌經形態及16S rDNA分子生物學鑒定為20株短乳桿菌(L.brevis)、7株布氏乳桿菌(L.buchneri)、16株植物乳桿菌株(L.plantarum)和4株戊糖乳桿菌(L.pentosus)。采用比濁法對4個屬的乳酸菌菌株自溶能力進行檢測發現，菌株自溶度與菌種沒有明顯的相關性，表現出菌株特異性。在白酒釀造的溫度范圍內(約15～35 ℃)，大多數菌株的自溶度隨溫度的升高而增加；在酒醅發酵的pH范圍內(3.5～6.5)，大多數菌株的自溶度隨pH的升高而增大。試驗初步了解了清香型白酒酒醅乳酸菌的自溶特性，但自溶過程中起主要作用的關鍵自溶酶和其自溶機理還有待進一步研究。