茶多酚對牛奶蛋白結構的影響

文鵬程，焦瑤瑤，張衛兵，楊敏，張炎，朱妍麗，馬瑞娟

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

茶多酚有益于人體健康，具有抗癌、抗氧化、預防心血管疾病、治療糖尿病和骨質疏松等作用[1-2]，茶多酚本身具有苦澀感，人們習慣將茶和牛奶結合，這樣既減少了茶的苦澀味，也提高了牛奶的抗氧化和乳化性等功能特性[3]。目前市場上推出越來越多與茶和牛奶相關的產品，主要有奶茶、抹茶冰淇淋、抹茶酸奶、綠茶干酪等。茶多酚對乳制品功能特性的影響與乳制品成分的相互作用密不可分。明確茶多酚對牛奶蛋白結構的影響，可以為乳制品功能特性的分析提供理論指導。本文旨在探討添加多酚對牛奶蛋白質結構的修飾作用。已有研究表明了兒茶素和模型溶液中純化牛奶蛋白之間的強相互作用。兒茶素與酪蛋白結合強烈，但與乳清蛋白，即α-乳清蛋白，β-乳球蛋白和牛血清白蛋白相互作用也有報道[4-6]。

早期研究表明茶多酚對蛋白質的修飾是通過分子間形成的氫鍵、疏水相互作用、離子鍵和范德華力等非共價鍵發生作用[7-8]。然而茶多酚與蛋白質相互作用還存在共價鍵的形式，主要是茶多酚在食品加工過程中酶促或非酶促氧化形成醌，醌作為一種極具高反應性的化合物，可以與其他醌進一步反應生成棕黑色化合物，也與蛋白質中賴氨酸的ε-氨基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基團形成C—N或C—S共價鍵[9-10]。在很多情況下，茶多酚-蛋白質的共價和非共價復合物可能同時存在，例如多酚與玉米醇溶蛋白形成的復合物[11]及茶多酚與牛血清白蛋白弱堿性條件下形成可溶性和不溶性的混合物[12]。

茶多酚與牛奶蛋白相互作用受多種因素的影響，乳制品加工過程中，熱處理是關鍵步驟之一，其主要是滅菌，但熱處理可能會導致一定程度的蛋白質變性。有研究表明向牛奶中添加茶多酚，能夠提高脫脂牛奶的熱穩定性[13]。但茶多酚與牛奶蛋白相互作用對牛奶蛋白質在熱處理過程中蛋白質結構的影響尚不完全清楚。因此，本研究主要是探討茶多酚對不同熱處理下牛奶蛋白結構變化規律，為乳制品功能特性的分析提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶，內蒙古伊利乳業公司蘭州分公司；茶多酚，酷爾化學試劑有限公司；沒食子酸、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，阿拉丁生化科技股份有限公司；EDTA、十二烷基磺酸鈉(SDS)、Na2HPO4、NaH2PO4等，天津市化學試劑三廠。

1.2 儀器與設備

高速臺式冷凍離心機(TGL-20)，長沙湘儀離心機儀器有限公司；熒光分光光度計(Shimadzu RF-540)，日本島津儀器公司； FTIR光譜儀(370)，美國Nicolet公司；紫外分光光度計(UV 5500PC)，上海元析儀器有限公司；集熱式磁力加熱攪拌(DF-Ⅱ)，器金壇市順華儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備

新鮮的牛奶進行標準化處理后進行15 413.3×g，15 min脫脂，再經0.45 μm的微孔過濾膜過濾以除去剩余的雜質，最后得到牛奶蛋白乳液加入0.02%的疊氮化鈉，用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH調pH至6.7。100 mL牛奶蛋白乳液中直接添加0.1、0.2、0.3 g的茶多酚粉末，然后用磁力攪拌器攪拌30 min[14]，再分別進行常溫25 ℃、65 ℃(30 min)和95 ℃(5 min)水浴加熱處理，加熱后的溶液立即進行冷卻處理，放置4 ℃備用。不加茶多酚的牛奶蛋白乳液進行同樣處理作為對照組。

1.3.2 濁度測定

以添加茶多酚前后的牛奶蛋白溶液為樣品，分別以添加0.01、0.2、0.3 g/100mL茶多酚的水溶液為參比，所用的樣品和參比溶液先進行適當稀釋(樣品的蛋白質量濃度在5 mg/mL)，然后在600 nm波長下采用紫外可見分光光度計測定牛奶蛋白溶液的吸光值，平行測定3次，取平均值，即為濁度[15]。

1.3.3 結合度測定

按照Folin-Ciocalteau方法測定總酚含量和復合到牛奶蛋白中的茶多酚量，首先制備沒食子酸的校準標準液，然后將茶多酚-牛奶蛋白復合物以截留分子質量為3 500 Da的再生纖維素膜4 ℃透析12 h，將透析液外的溶液(或沒食子酸標準液)取200 μL與7.8 mL蒸餾水和0.5 mL的Folin-Ciocateu試劑混合，靜置5 min。然后加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，搖勻，室溫下避光靜置2 h，使用分光光度計以蒸餾水做空白測765 nm處的吸光值。形成茶多酚復合物的百分比和每毫克牛奶蛋白結合的茶多酚百分比計算如公式(1)和公式(2)[14]所示：

綁定的茶多酚/%

(1)

綁定茶多酚/牛奶蛋白/%

(2)

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

1.3.4 熒光測定

將牛奶蛋白溶液和茶多酚-牛奶蛋白復合物用PBS (0.01 mol/L，pH 7.0)緩沖溶液制成 2 mg/mL的溶液。采用熒光分光光度計在25 ℃下測定其內源熒光發射光譜，激發波長設定為280 nm，發射光譜采集范圍為 290～500 nm，激發波長與發射波長狹縫均為 5.0 nm[16]；ANS熒光測定時，取上述溶液8 mL，再加入200 μL濃度為 8.0×10-3mol/L的 ANS 熒光試劑，振蕩，靜置3 min。采用熒光分光光度計在室溫下測定其熒光發射光譜，激發波長設定為390 nm，發射光譜采集范圍為400～650 nm[17]。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜

將牛奶蛋白和茶多酚-牛奶蛋白復合物冷凍干燥。通過混合300 mg光譜級KBr與2～3 mg所得樣品制備KBr顆粒，并用壓機在4 t壓力下將混合物壓制成13 mm片狀固體。用370 FTIR光譜儀從400～4 000 cm-1記錄顆粒的光譜[18]。

1.3.6 巰基含量測定

移去牛奶蛋白或茶多酚-牛奶蛋白復合物加入到2.5 mL的Tris-Gly緩沖溶液(含8 mol/L尿素)中，再加入0.02 mL Ellman’s試劑(含5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)的Tris-Gly緩沖溶液)靜置5 min，在412 nm處測定吸光值，游離巰基含量計算如公式(3)[19]：

(3)

式中：A412，412 nm處的吸光值；D，稀釋因子，6.04；C，樣品濃度。

1.4 統計學分析

實驗數據采用Excel軟件統計，Origin 64軟件作圖，最終實驗結果應用SPSS 19.0軟件中的ANOVA進行顯著性分析，以P<0.05具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 牛奶蛋白的主要成分分析

生鮮牛奶是制備其他乳制品的關鍵原料，牛奶蛋白的主要成分是影響茶多酚與蛋白質相互作用的關鍵因素。本實驗所用的原料乳為荷斯坦牛奶，對其進行標準化，表1是對原料乳進行標準化的結果，所測結果均符合GB19301—2010食品安全國家標準生乳要求。

表1 原料乳的基本成分Table 1 Comical composition of raw milk

注：表中數據均為平均值±標準差

2.2 濁度

由圖2可以看出，在不同熱處理下，茶多酚對牛奶蛋白濁度影響趨勢不同。25 ℃和65 ℃處理下，牛奶蛋白的濁度隨茶多酚質量濃度的增加而降低，而95 ℃時，隨茶多酚質量濃度增加，濁度有所增加。茶多酚富含大量活性羥基，能與蛋白質的肽羰基間形成氫鍵，多酚芳香環能與蛋白質中脯氨酸殘基的吡咯烷環之間形成疏水相互作用[7]，降低了牛奶蛋白在熱處理下的熱聚效應，因此降低了蛋白質的濁度。O′CONNELL等[13]研究表明向牛奶中添加茶多酚，能夠提高脫脂牛奶的熱穩定性和酒精穩定性。95 ℃熱處理時，牛奶蛋白中的乳清蛋白高度變性，增強了蛋白質之間的相互作用，這可能是影響蛋白質濁度增加的主要原因。早期研究發現酪蛋白可與茶多酚形成可溶性的復合物，而乳清蛋白的存在似乎影響了茶多酚與酪蛋白的作用；在沒有酪蛋白的情況下，乳清蛋白與茶多酚的相互作用形成可溶或不溶的蛋白質-多酚復合物[20]。

圖2 茶多酚-牛奶蛋白復合物的濁度Fig.2 Turbidity of tea polyphenol-milk protein complexs注：不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示組內差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 結合度

茶多酚與牛奶蛋白復合物經過透析后得到與牛奶蛋白未結合的游離茶多酚，通過福林酚法測定游離茶多酚含量，然后再經公式(1)和公式(2)計算結合在牛奶蛋白上的茶多酚和茶多酚/牛奶蛋白的比例。由圖3-A可以看出，同一溫度不同茶多酚添加量下，與蛋白質結合的茶多酚隨茶多酚添加量的增加而呈上升趨勢，在65 ℃時，茶多酚結合度明顯高于25 ℃和95 ℃處理，這可能歸因于65 ℃處理時，乳清蛋白中除去乳球蛋白(β-Lg)，其他乳清蛋白單體略有熱變性現象[21]，而變性的乳清蛋白球狀結構會去折疊化變得舒展，表面暴露出更多疏水性基團簇，為茶多酚的結合提供位點，使得茶多酚的結合度提高。

A-茶多酚-牛奶蛋白復合物中茶多酚的結合度圖；B-茶多酚/牛奶蛋白的百分比圖圖3 茶多酚-牛奶蛋白的結合能力分析圖Fig.3 Binding capacity of tea polyphenol-milk protein complexs

在生鮮脫脂牛奶蛋白中，低濃度的茶多酚主要以結合酪蛋白為主，當茶多酚與酪蛋白結合度達到飽和狀態時，牛奶蛋白中剩余的茶多酚會與乳清蛋白結合[1]，致使牛奶蛋白質與茶多酚的結合度增加。由圖3-B可以看出，隨著茶多酚添加量的增加，每毫克牛奶蛋白結合的茶多酚以恒定的增量變化，這與孫紅波等[22]對花青素和大豆蛋白相互作用的研究結果類似。茶多酚-牛奶蛋白復合物在65 ℃和95 ℃加熱后，茶多酚/蛋白質百分比例高于25 ℃處理，這主要歸因于牛奶蛋白中存在的乳清蛋白在熱處理后會發生熱變性，使得與茶多酚有效結合的蛋白含量增加，茶多酚/蛋白質百分比例升高。當茶多酚添加量為0.2 g/100mL和0.3 g/100mL，95 ℃處理的茶多酚/蛋白質百分比例顯著(P<0.05)低于65 ℃處理。牛奶蛋白中的乳清蛋白熱敏性極高，研究表明，乳清蛋白發生變性包括2個主要的階段：一是當溫度大于60 ℃時，蛋白質的球狀結構發生改變，進而發生變性反應；二是未折疊乳清蛋白與其他乳清蛋白或酪蛋白膠粒結合[23]。因此，95 ℃處理時，茶多酚/蛋白質百分比例的降低可能歸因于變性的乳清蛋白與酪蛋白間相互作用增強，使得茶多酚對蛋白質的作用效果減弱。

2.4 蛋白質內源熒光和外源熒光分析

熒光猝滅被認為是測量結合親和力的有用技術。熒光猝滅是由于猝滅劑分子與大分子化合物相互作用誘導熒光基團的熒光量子產率降低的現象。茶多酚作為一種小分子化合物與牛奶蛋白質結合，導致蛋白質中色氨酸(Trp)基團的熒光強度降低。由圖4可知，同一溫度處理下，隨著茶多酚添加量的增加，熒光強度明顯降低。說明Trp微環境發生變化，這可能歸結于茶多酚被蛋白質包埋在疏水性區域，茶多酚的芳香族環與蛋白質脯氨酸殘基的吡咯烷環之間形成疏水相互作用，酚羥基和羰基之間形成氫鍵[8]。熱處理同樣會改變牛奶蛋白的熒光強度，在65 ℃和95 ℃熱處理下的牛奶蛋白，熒光強度相對于25 ℃時的略顯先升后減的變化，其結果與HE等[24]研究的β-CN熱處理的結果相似。由此可見，加熱溫度從25 ℃上升至65 ℃時，熱誘導對牛奶蛋白的結構伸展和親和性的影響較小，而熱處理溫度從65 ℃升高至95 ℃時，熱誘導對牛奶蛋白結構的影響較大。在茶多酚-牛奶蛋白體系中，所有富含茶多酚的蛋白質樣品，其三級結構穩定性都比未添加茶多酚時的強。除此之外，所有樣品的Trp最大發射波長均在336～339 nm。研究指出，當 λmax為335～350 nm 時，Trp處于極性較低的微環境中，也就是說它們被包埋于蛋白質內部疏水性較強的區域；λmax為350～353 nm，Trp殘基暴露于水中，微環境親水性增強[25]。因此，可以看出，在茶多酚存在的情況下，對牛奶蛋白進行熱處理Trp仍處于疏水性環境中，表明蛋白質內部結構完好，說明茶多酚對牛奶蛋白的修飾只是在疏水性環境中改變Trp微環境并沒有破壞蛋白質的三級結構。

圖5顯示了牛奶蛋白的ANS探針熒光發射光譜。由圖5可以看出牛奶蛋白膠束的ANS熒光強度隨著茶多酚添加量的增加而降低，這與蛋白質內源熒光的測定結果相似。ANS作為熒光探針監測蛋白結構的變化其主要原因是其帶有負電荷的—SO3，可以與牛奶蛋白疏水性區域表面肽段陽離子氨基酸殘基結合，如賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)[25]。ANS的熒光強度取決于這些氨基酸殘基所處微環境的極性。茶多酚與牛奶蛋白相互作用會產生幾種作用力，其中之一是離子鍵，茶多酚帶負電荷的酚羥基與Lys 的ε-氨基殘基正負電荷相互作用，而這種相互作用可能會影響ANS結合在牛奶蛋白膠束上，所以才會導致ANS的熒光強度降低[26]。

A-25 ℃;B-65 ℃；C-95℃；數字1～4分別表示茶多酚添加量為0、0.1、0.2和0.3 g/100mL圖4 茶多酚-牛奶蛋白內源熒光發射光譜Fig.4 Endogenous fluorescence emission spectra of tea polyphenol-milk protein complexs

由圖4和圖5可以看出，蛋白質內源和ANS外源熒光強度都隨茶多酚濃度的增加而降低，說明蛋白質表面疏水性降低，蛋白質疏水性基團內卷，使得蛋白質三級結構更穩定，這可能是由于茶多酚與牛奶蛋白通過分子間相互作用(如氫鍵)收緊蛋白質結構所致。HASNI等[27]研究認為茶多酚與酪蛋白單體(即α-CN和β-CN)之間的相互作用似乎也使得色氨酸包埋在更疏水的環境中。

2.5 蛋白質二級結構分析

采用Peak Fit軟件處理酰胺I帶(1 600 ～ 1 700 cm-1)，根據積分面積計算各種二級結構的相對百分含量，二級結構波數范圍劃分如下：其中1 615～1 637 cm-1為β-折疊，1 638～1 645 cm-1為無規卷曲；1 646～1 664 cm-1為α-螺旋；1 665～1 685 cm-1為β-轉角；1 690～1 700 cm-1為反β-折疊[18]。牛奶蛋白和茶多酚-牛奶蛋白復合物紅外光譜酰胺 Ⅰ 帶高斯擬合圖見如6所示，各二級結構含量如表2所示。從表2中可以看出，牛奶蛋白二級結構以α-螺旋和β-轉角為主，其含量分別為28.54%和 30.37%。蛋白結構中18.36% β-折疊，18.87%無規卷曲和3.86%反β-折疊。這與YE等[18]測定的脫脂乳蛋白二級結構結果類似。

表2 熱處理牛奶蛋白和茶多酚-牛奶蛋白復合物中二級結構的相對含量Table 2 Relative content of secondary structure in heat-treated milk protein and tea polyphenol-milk protein complex

注：小寫字母a～c表示組間差異顯著(P<0.05)，大寫字母A～C表示組內差異顯著(P<0.05)

圖6 茶多酚和熱處理共同作用對牛奶蛋白膠束酰胺Ⅰ帶高斯擬合圖Fig.6 Gaussian curve fitting of Amide I regions in milk protein micelle with tea polyphenols and heat treatment

茶多酚對牛奶蛋白二級結構的影響如表2所示，在25 ℃時，蛋白質二級結構中無規卷曲和β-轉角含量隨著茶多酚濃度的增加而增加，β-折疊和α-螺旋含量減少。當熱處理溫度為65 ℃時，茶多酚的添加量對β-轉角和反α-折疊含量變化并不顯著(P<0.05)，但β-轉角含量隨茶多酚濃度的升高從23.13%增加至32.87%，同時無規卷曲含量從9.36%增加至20.31 %，而α-螺旋含量從49.15 %顯著(P<0.05)降低至25.86%。熱處理溫度達95 ℃時，其測定結果與25 ℃處理相似。由此可以得到，在同一溫度不同茶多酚濃度處理下，蛋白質二級結構變化趨勢為α-螺旋和β-折疊含量減少，無規卷曲和β-轉角含量增加。而α-螺旋和β-折疊層的形成主要是蛋白質分子間氫鍵的作用，α-螺旋和β-折疊層減少，說明茶多酚與牛奶蛋白的相互作用破壞了蛋白質分子間的氫鍵[28]，氫鍵的斷裂使得蛋白質結構由規則向無規則轉化；β-轉角含量增加，說明蛋白質結構中又重回新組合成新的氫鍵，這與茶多酚酚羥基與蛋白質肽羰基之間形成的氫鍵有關[7]。KANAKIS等[29]指出添加多酚后蛋白質結構的變化，即α-螺旋和β-折疊二級結構的增加以及無規卷曲的減少。而HASNI等[27]探討了在多酚相互作用下，酪蛋白二級結構中α-螺旋和β-折疊層發生了主要的減少，而多酚-酪蛋白復合物中出現了轉角和無序結構的增加。SHPIGELMAN等[30]研究發現EGCG與加熱的β-Lg的結合將蛋白質二級結構向無規卷曲轉變。蛋白質二級結構的變化可能會引起蛋白凝膠結構的變化。

2.6 蛋白質巰基含量

巰基是蛋白質凝膠形成的一個關鍵因素。由圖7可知，牛奶蛋白的巰基含量約在15～20 μmol/g，這與羅明江等[19]測定的牛奶中巰基含量相似。在25 ℃處理時，巰基含量與茶多酚添加量無規律關系；而在65 ℃時，隨著茶多酚添加量的增加，游離巰基從17.61 μmol/g增加至19.11 μmol/g；當溫度達95 ℃時，游離巰基從19.89 μmol/g減少到16.58 μmol/g。

圖7 茶多酚對熱處理過程中牛奶蛋白巰基含量的影響Fig.7 Effect of tea polyphenols on the content of milk protein sulfhydryl content during heat treatment

乳清蛋白屬于熱敏性蛋白，65 ℃加熱處理后，其球狀結構開始去折疊化變得舒展，此時加入茶多酚，會導致牛奶蛋白質中游離的巰基數量增加，主要是因為乳清蛋白結構中引入了酚羥基，而茶多酚芳香族環的空間效應使得蛋白結構中原有的二硫鍵斷裂。當溫度達95 ℃時，乳清蛋白的熱變性程度增大，β-Lg的變性程度約為60%，α-LA為50%[21]，蛋白質去折疊化釋放游離巰基成為引起硫醇/二硫化物與其他蛋白質交換關鍵作用基團[31-32]。加入茶多酚后，游離巰基數量顯著減少，可能與茶多酚作為一種含有大量酚羥基基團的化合物，可以與牛奶蛋白中的巰基結合，進而造成巰基含量的降低有關；也可能是牛奶蛋白經高溫處理后，乳清蛋白所暴露出來的巰基與其自身或κ-酪蛋白發生巰基-二硫化物交換形成二硫鍵有關[23]；此外，也有可能是茶多酚通過某種途徑形成醌化合物與牛奶蛋白以共價鍵C—S的形式結合使巰基含量減少[33]。徐潔瓊[34]探討了熱處理對茶多酚與牛奶對蛋白相互作用的影響，證實了熱處理條件下，茶多酚單體與蛋白質單體之間主要以非共價形式作用，但不排除茶多酚與乳清蛋白之間存在共價結合形式。茶多酚對蛋白質游離巰基的影響可能會使得蛋白質凝膠結構不同。

3 結論

本試驗探究了茶多酚對不同熱處理下牛奶蛋白結構影響規律。試驗結果顯示，隨著茶多酚添加量的增加，茶多酚與牛奶蛋白的結合程度增加。65 ℃時，結合程度達到最大，此時，其蛋白質濁度隨著茶多酚添加量的增加而降低，游離巰基含量增加；而95 ℃時，蛋白質濁度隨茶多酚添加量的增加而升高，游離巰基含量降低；蛋白質二級結構中α-螺旋和β-折疊含量減少，無規卷曲和β-轉角含量增加，蛋白質分子間的氫鍵斷裂，蛋白質結構由規則向無規則轉化。此外，蛋白質內源和ANS外源熒光強度降低，表面疏水性降低，蛋白質疏水性基團內卷，茶多酚在較疏水的環境中改變Trp微環境并沒有破壞蛋白質內部結構，進而使得蛋白質三級結構較穩定。茶多酚對牛奶蛋白結構的影響不容小覷，其宏觀表現在對牛奶蛋白濁度影響規律不同，此研究為富含茶多酚-牛奶蛋白復合物食品，在分析功能特性和生物學效應方面提供理論指導。