中高溫大曲中酵母菌的分離及其在小曲酒中發酵性能初探

郭燕，鐘遲迪，董曉山，衛春會,2，任志強,2*

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644000)2(四川輕化工大學,釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644000)

大曲是一種同時含有微生物菌系、微生物酶系和復合曲香物的微生態制品，是大曲酒釀造過程中重要的產酒劑和生香劑[1-2]。大曲中的微生物主要包括細菌、霉菌和酵母菌，而大曲中的酵母菌主要分為產酒酵母和產香酵母兩大類[3-5]。產酒酵母多屬于釀酒酵母屬，為白酒發酵提供動力；而產香酵母多屬于漢遜酵母屬、假絲酵母屬和球擬酵母屬，既具備酒精發酵能力又具備醋酸發酵能力，是白酒中酯香的主要產生菌[6]。

目前，以純種根霉和酵母為糖化發酵劑生產的小曲白酒因其用曲量少、發酵周期短、出酒率高、操作簡便、價格實惠以及風格獨特、味道適宜等特點在各地方穩定發展且深受消費者的喜愛[7]。但小曲白酒因其酒體單薄、香氣不足等缺點，相較于大曲酒還缺乏市場競爭力[8]。近年來，隨著釀酒技術的發展，人們在傳統工藝的基礎上，通過改進生產工藝、生產設備和生產菌株，逐步提高了小曲白酒的產量和質量。如池彬等[9]發現，利用多菌種大小曲混合釀造苦蕎麥酒可以彌補和改善單一使用小曲造成的小曲酒酒質薄弱等問題；程偉等[10]表明，在固態小曲清香型白酒釀造生產工藝的基礎上添加質量分數為0.05%的安琪生香活性干酵母，可明顯提高原酒中的乙酸乙酯和總酯的含量，使原酒香味更加協調，口感清香純正。

大曲中的微生物種類繁多且復雜。目前，鮮有利用大曲中的優質菌株生產高質量小曲白酒的有關報道，僅有夏玙等[11]從大曲中分離到1株異常威克漢遜酵母并用于制作純種麩曲，優化制曲工藝后應用于清香型小曲白酒的生產，發現小曲酒中的乙酸乙酯增加了3倍，總酯增加了2倍。因此，本試驗從大曲中分離純化出產酒或產香酵母菌，通過制作米曲以及釀酒試驗初步探索大曲中的酵母菌在小曲酒的發酵性能，以活菌數和酒精度為檢測指標，以期將大曲中的酵母菌應用于小曲酒的發酵生產，為提高小曲酒的產量與質量提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麩皮、糯米，市售；中高溫濃香型大曲，四川某濃香型酒廠；麥芽汁瓊脂，北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖(分析純)、NaCl(分析純)、瓊脂粉，成都市科龍化工試劑廠；酵母提取物，生工生物工程(上海)股份公司；糖化酶(105U/g)，博立生物制品有限公司；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒，北京智杰方遠科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AR2140電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；CI54DS立式壓力蒸汽滅菌鍋，廈門儀器有限公司；LRH-250生化培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，上海博訊實業有限公司；ECLIPSE-E100光學顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司；C1000-Touch PCR儀，伯樂生命醫學產品(上海)有限公司。

1.3 培養基

麥芽汁瓊脂培養基(malt extract agar, MEA)：麥芽汁瓊脂20 g，蒸餾水定容至500 mL，pH(7.0±0.1)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar, PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。

1.4 試驗方法

1.4.1 中高溫大曲中真菌群落分析

采用改良的CTAB法[12]提取中高溫大曲中微生物DNA，將提取的DNA送至上海美吉生物醫藥科技有限公司完成PCR-DGGE高通量測序。

1.4.2 酵母菌的分離與純化

稱取粉碎后的大曲樣品1.0 g，在無菌條件下加入99 mL帶有玻璃珠的無菌水中，搖勻，制備成10-2稀釋液，再將其濃度稀釋至10-3～10-6，取各梯度稀釋液100 μL涂布于MEA固體培養基上，28 ℃倒置培養3 d。挑取單菌落，平板劃線至無雜菌后接于斜面保藏并編號。

1.4.3 酵母菌的形態學觀察

將菌株接于PDA培養基上，觀察并記錄酵母菌在PDA培養基上的菌落顏色、形狀、濕潤程度、邊緣是否整齊、表面是否光滑等菌落特征，并在顯微鏡下觀察酵母菌的細胞形狀及繁殖方式，參比《酵母菌的特征與鑒定手冊》[13]對酵母菌進行鑒定。

1.4.4 酵母菌18s rRNA分子生物學鑒定

參考文獻[14-16]提取酵母菌菌株的基因組DNA。以序列NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′為正向引物和NS4：5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′為反向引物擴增酵母菌18S rRNA序列。反應體系(50 μL)為：MasterMix 25 μL；引物NS1和 NS4各1 μL；模板DNA 2 μL；雙蒸水21 μL。反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；循環29次；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，按照試劑盒操作步驟回收條帶，產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4.5 酵母菌菌株同源性分析

將測序結果在Genebank數據庫中進行同源序列搜索，與相似性>99%的菌株作比較，采用MEGA 7.0 軟件進行多序列對比，采用鄰接法(neighbour-joining)構建系統發育進化樹。

1.4.6 酵母菌發酵能力的測定

1.4.6.1 酵母菌種子液的制備

在無菌條件下，挑取2～3環酵母菌接入100 mL PDA液體培養基中，于28 ℃，150 r/min培養48 h，在顯微鏡下觀察酵母菌的生長狀態并計數。

1.4.6.2 純種酵母麩曲的制作

稱取50.0 g麩皮于500 mL三角瓶中并加入50 mL去離子水，攪拌均勻后，于121 ℃溫度下滅菌20 min，冷卻后在無菌條件下對麩皮進行攪拌，保證麩皮松散且不成團，按接種量為1.0×107CFU/g麩曲接入酵母菌種子液，于28 ℃，50 r/min培養5 d，將培養完成后的麩曲倒入托盤中，烘干后打碎成粉并計算麩曲中的活酵母數，于4 ℃冷藏待用。

1.4.6.3 米曲的制作

米曲的制作工藝流程[17]如下：

粉碎、潤料：準確稱取3.0 kg大米并將其粉碎，粉碎的大米經100目篩孔過篩，要求粗細比為3∶1。潤料目的是使大米吸水膨脹，淀粉粒間隙增大，利于糊化。水溫為100 ℃，要求潤料后的大米含水質量分數在38%～50%[18]。

接種、制坯與培養：按活酵母菌數為6.0×108CFU/g米曲接種。將麩曲與米粉混合均勻后，揉合成質量約40 g、大小均勻且一致的球狀曲，以便于在培養時控制溫度和水分。28 ℃下培養9 d，濕度保持在90%；

烘干、貯存：米曲培養成熟出箱后，于60 ℃恒溫箱中烘干48 h，使其水分降低至12% 以下，以利于保存。

1.4.6.4 米曲的工藝優化

含水量對酵母菌生長的影響：按照米曲的制作工藝，將潤料后的米曲含水質量分數分別控制在38%、40%、42%、44%、46%、48%、50%，于28 ℃、濕度90%的條件下培養，每天觀察其生長情況，5 d后裝入托盤，烘干后粉碎并計算米曲中的活酵母菌數，確定米曲最佳含水量。

培養時間對酵母菌生長的影響：確定了米曲的最佳含水量后，按照米曲的制作工藝，將米曲分別在28 ℃、濕度90%的條件下培養1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 d，將培養完成的米曲烘干后粉碎并計算米曲中的活酵母菌數，確定米曲的最佳培養時間。

1.4.6.5 釀酒試驗

釀酒工藝流程如下：

粉碎與潤料：稱取4.0 kg高粱并粉碎成2、4、6瓣，能通過100目篩孔的細粉占20%～40%，整粒和含殼量控制在0.5%以下。破碎后的高粱用常溫水浸泡，使水面淹沒糧食2～3 cm，翻動并刮平表面，浸泡12 h即可。

蒸糧：目的使高粱受熱膨脹，促使淀粉粒細胞膜破裂。使用高溫蒸汽直接加熱，初蒸15～20 min后敞蓋燜水55～60 min，再復蒸30～40 min。

打量水：在溫度差的作用下，高粱皮外收縮，皮內淀粉粒收到擠壓，從而導致淀粉粒細胞膜結構破壞，經過不斷攪拌和蒸發收汗，使高粱的含水量增大，利于后續糖化發酵。量水溫度溫控制在70～80 ℃，用水量占原料總質量的50%，打完量水后冷卻至40 ℃。

下曲：由于糖化發酵劑使用的是純種酵母米曲，缺乏霉菌的作用，淀粉可能無法正常進行糖化，從而導致發酵不能正常啟動。因此，以接種量為原料質量0.4%的糖化酶和0.6%的糖化酶為試驗組，以只添加原料質量1.0%的糖化酶為對照組。

堆積發酵和入缸發酵：當曲與高粱混勻后，蓋上紗布，堆積糖化12 h，使酵母在有氧條件下進行生長和繁殖，然后入缸泥封發酵7 d后上甑蒸酒。

1.5 測定方法

水分測定采用常壓干燥法[19]；酵母菌計數采用稀釋平板計數法[20]；酒精度采用定量蒸餾100 mL酒液的方法，用酒精計測定[21]。

1.6 數據處理

試驗結果均用“平均值±標準差”表示。應用Excel 2007對試驗數據進行分析，并采用SNK-q檢驗對結果進行多重比較。每組試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 中高溫大曲中真菌群落組成分析

大曲作為一種營養載體，通過富集和篩選環境中的微生物以積累豐富的物系、酶系和菌系而具有釀造功能。基于屬類水平對中高溫大曲樣品的高通量測序結果進行分析，如圖1所示。結果表明，3種中高溫大曲中均含7種相同優勢真菌屬(豐度>1%)，分別為假絲酵母屬(Candida)、赤霉菌屬(Gibberella)、Wickerhamomyces、側齒霉屬(Engyodontium)、酵母菌屬(Saccharomyces)、曲霉菌屬(Aspergillus)、匍柄霉屬(Stemphylium)。在3種不同的中高溫大曲中，酵母菌和霉菌在真菌中占優勢地位，且酵母菌占真菌的比例為48.16%～52.34%，而霉菌占 24.94%～29.04%。大曲中，大量的酵母菌保證了白酒釀造過程中的發酵能力、產酯能力和產酒能力[21-23]，霉菌又保證了糖化力、液化力和酯化力[24-27]，二者相輔相成，對白酒風味具有積極作用。

圖1 不同中高溫大曲中真菌群落結構Fig.1 Structure chart of fungi community in different medium high-temperature Daqus

2.2 酵母菌的分離與鑒定

2.2.1 酵母菌株的形態學特征

在MEA培養基上共挑取了20個單菌落，經過3～4次劃線純化至無雜菌后，結合菌落特征以及顯微鏡下的觀察結果，初步確定從大曲中分離出4株酵母菌，分別編號為Y1、Y2、Y3和Y4，其在PDA上的菌落形態特征和顯微鏡下形態特征如表1所示。

表1 四株酵母菌的菌落及細胞形態特征Table 1 The cell and colony morphological characteristics of four kinds of yeasts

2.2.2 酵母菌的分子生物學鑒定

2.2.2.1 酵母菌PCR擴增結果

4株酵母菌的PCR擴增產物電泳圖如圖2所示。由圖2可知，4株菌株的擴增產物無拖尾現象，無降解，完整性較好。

圖2 四株酵母菌PCR擴增產物電泳圖Fig.2 The PCR products electrophoretogram of four kinds of yeasts

2.2.2.2 四株酵母菌的系統發育進化樹

Y1、Y2、Y3和Y4 酵母菌的18S rRNA PCR擴增產物測序后的長度分別為1 480、1 365、1 389和1 264 bp。將4株酵母菌的18S rRNA測序結果在NCBI的GeneBank中進行BLAST對比，結果表明，Y1菌株序列與Wickerhamomycesanomalusstrain 0939-5的同源性達99.75%，該菌株與其他近源菌株和模式菌株18S rRNA序列構建的系統發育進化樹如圖3所示，Y1菌株與序列號為MG712300.1的異常威克漢遜酵母遺傳距離最近。Y2菌株序列與CandidaodintsovaeNRRL Y17730的同源性達99.36%，該菌株與其他近源菌株和模式菌株18S rRNA 序列構建的系統發育進化樹如圖4所示，Y2菌株與序列號為EF550442.1的東方假絲酵母遺傳距離最近。Y3菌株序列與SaccharomycescerevisiaeYJM555的同源性達99.77%，Y4序列與SaccharomycescerevisiaeRY1的同源性達99.58%，這2株酵母菌與其他近源菌株和模式菌株18S rRNA序列構建的系統發育進化樹如圖5所示，Y3菌株與序列號為CP006452.1的釀酒酵母遺傳距離最近，而Y4菌株與序列號為LC479088.1和MN117709.1的釀酒酵母遺傳距離最近。結合4株酵母菌的形態學特征，初步確定Y1為異常威克漢遜酵母(Wickerhamomycesanomalus)，Y2為東方假絲酵母(Candidaodintsovae)，Y3和Y4為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

圖3 Y1菌株的系統發育進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain Y1

圖4 Y2菌株的系統發育進化樹Fig.4 The phylogenetic tree of strain Y2

圖5 Y3和Y4菌株的系統發育進化樹Fig.5 The phylogenetic tree of strain Y3 and Y4

2.3 四株酵母菌的發酵性能測定

2.3.1 麩曲中4株酵母菌活菌數

由圖6可知，4種酵母在麩曲中的活酵母菌數分別為異常威克漢遜酵母Y1為5.27×108CFU/g麩曲，東方假絲酵母Y2為4.77×108CFU/g麩曲，釀酒酵母Y3和Y4均為5.2×108CFU/g麩曲。4株酵母菌在麩曲中的數量差異不明顯(P>0.05)，且數量相較于培養前可放大一個數量級。

圖6 四種酵母麩曲中的活酵母菌數Fig.6 The number of viable yeasts in four kinds of fuqu注：圖中相同小寫字母代表差異不顯著(P>0.05)

2.3.2 米曲含水量對酵母菌生長的影響

在制曲過程中，水分含量對曲的質量起著重要作用[28]。大米淀粉是一種較易水解的淀粉，適當的水分不僅可以使大米充分吸水膨脹，溶解其營養物質于水中，為后期酵母的活動提供養料，同時還可以促進酵母菌的生長繁殖和酶的分泌[29]。由圖7可知，4種酵母菌活菌數均隨著米曲含水量的增加呈先增后降的趨勢。異常威克漢遜酵母菌Y1在米曲含水質量分數為44%～48%時活酵母菌數與其他含水質量分數存在顯著差異(P<0.05)，東方假絲酵母Y2在米曲含水質量分數為42%～48%時活酵母菌數與其他含水質量分數存在顯著差異(P<0.05)，釀酒酵母Y3在米曲含水質量分數為44%～46%時活酵母菌數與其他水分含量存在顯著差異(P<0.05)，釀酒酵母Y4在米曲含水質量分數為46%時活酵母菌數與其他水分含量存在顯著差異(P<0.05)。4種酵母菌米曲中的活酵母菌數均在含水質量分數為46%時達最大，其中釀酒酵母Y4米曲中活酵母數最高，為5.60×109CFU/g米曲，異常威克漢遜酵母Y1米曲中的活菌數為5.50×109CFU/g米曲，釀酒酵母Y3米曲中活酵母數為5.43×109CFU/g米曲，東方假絲酵母Y2米曲中活酵母數為5.1×109CFU/g米曲，這說明從大曲中分離出來的4株酵母菌均能在含水質量分數為46%的米曲中旺盛繁殖。但過高的水分含量不利于酵母菌的生長，可能是由于過高的水分招致了細菌的繁殖，從而抑制了酵母菌的生長。

2.3.3 制曲時間對酵母菌生長的影響

酵母菌是酒精發酵的主要動力。在一定程度上，酵母菌的數量越高，越有利于發酵產酒。由圖8可知，隨著培養時間的延長，4種米曲中的酵母菌均呈先增后降的趨勢，且活酵母菌數均在培養3 d后出現顯著差異(P<0.05)。在制曲第7天，4種米曲中的活酵母菌數均達最大，其中釀酒酵母Y4米曲中活酵母數最高，為8.37×109CFU/g米曲。東方假絲酵母Y2米曲中的活酵母數為8.17×109CFU/g米曲，釀酒酵母Y3米曲中活酵母數為8.10×109CFU/g米曲，異常威克漢遜酵母Y1米曲中的活酵母數為7.57×109CFU/g米曲。由圖8可知，從大曲中分離的4株酵母在米曲含水質量分數為46%時培養7 d生長繁殖最為旺盛。

a-Y2；b-Y2；c-Y3；d-Y4圖7 含水量對4種米曲中酵母菌活菌數的影響Fig.7 Effect of water contents on the viable counts of yeast in four kind of rice Qus注：圖中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

a-Y1；b-Y2；c-Y3；d-Y4圖8 制曲時間對4種酵母米曲中活菌數的影響Fig.8 Effect of incubating time on the viable counts of yeast in four kind of rice Qus

2.4 釀酒試驗

因釀酒過程為開放式操作，原料在操作過程中會網絡部分空氣中微生物，導致對照組能發酵產酒，且酒精度為16.5%vol。由表2可知，釀酒酵母Y3和Y4的酒精度顯著高于異常威克漢遜酵母Y1和東方假絲酵母Y2菌株(P<0.05)，且釀酒酵母Y3比Y4產酒效果更為顯著(P<0.05)。米曲與糖化酶結合發酵生產的小曲高粱酒酒精度比直接使用糖化酶的酒精度變化顯著(P<0.05)，這說明4種不同酵母米曲具有較好的產酶與產酒效果，且4種酵母米曲的產酒能力依次為釀酒酵母Y3>釀酒酵母Y4>異常威克漢遜Y1>東方假絲酵母Y2。

表2 四種酵母米曲發酵高粱產酒情況 單位：%volTable 2 The Xiaoqu baijiu production of sorghum fermented by four kinds of rice Qus

注：表中相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 結論

從中高溫大曲中共分離出4株酵母菌(Y1、Y2、Y3和Y4)，經形態學和分子生物學鑒定，確定Y1為異常威克漢遜酵母，Y2為假絲酵母，Y3和Y4釀酒酵母。4株酵母制得的米曲在含水質量分數為46%的條件下下培養7 d，酵母活菌數可達109CFU/g米曲。通過釀酒試驗發現，4種酵母米曲的產酒能力依次為釀酒酵母Y3>釀酒酵母Y4>異常威克漢遜酵母Y1>東方假絲酵母Y2。在報道中[30-32]，異常威克漢遜酵母和東方假絲酵母在白酒發酵中具有產香功能，而從本試驗可看出，這2株酵母具有一定的產酒能力，因此可對其功能進行進一步研究，以期為改善小曲酒的質量與產量提供理論基礎。大曲中存在著紛繁且復雜的微生物，認識與開發這些功能微生物，并將其運用在小曲酒的生產過程中，可為創新小曲酒工藝，提高小曲酒質量提供新思路與新方法。