本土釀酒酵母發酵梅鹿輒干紅動態變化研究

趙雪平，鄭海武，雷蕾，李婷，張美枝*，李正英

1(內蒙古農業大學 職業技術學院，內蒙古 包頭，014109) 2(內蒙古農業大學，內蒙古 呼和浩特，010018)

我國是世界葡萄酒消費增長速度最快的國家，人均葡萄酒消費量居世界前列[1]，已逐漸成為葡萄酒生產和消費大國[2]。葡萄酒的釀造關鍵在于葡萄原料、工藝及發酵菌株。我國具有多個優良的釀酒葡萄產區及成熟的發酵釀造工藝，但目前葡萄酒釀造多采用進口菌株，提高了釀造成本，降低了本土葡萄酒特色。我國的釀酒葡萄產區具有多樣性，葡萄種植歷史同樣比較悠久，為野生酵母篩選提供了寶貴的自然菌種庫，挖掘本土特色釀酒酵母具有一定的研究意義。

酵母菌種對葡萄酒的品質影響很大，優良的酵母菌不僅能夠保證發酵的正常完成還能夠改善葡萄酒的品質[3]。葡萄酒的品質受到酸甜度的影響同時也受到酒精度、花色苷、單寧、總酚等影響。葡萄酒中的酸度一部分是由葡萄果實提供，一部分則由酵母發酵代謝產生。葡萄酒的酒精度是酵母發酵葡萄糖產生的，自身繁殖和代謝消耗葡萄糖產生酒精、甘油等物質。酚類物質在葡萄酒中扮演重要角色，酚類物質會影響葡萄酒的澀味、苦味、香氣和顏色。所以準確測定葡萄酒中的總酚對評判葡萄酒品質有重要意義，同時可判斷不同釀酒酵母之間總酚的差異。葡萄中主要的酚類物質為總花色苷、酚酸、單寧和黃酮類物質四大類。葡萄酒中的酚類不僅僅來自葡萄本身，還來自發酵過程中釀酒酵母的分解和老化過程中橡木的提取物。酚類化合物對葡萄酒的顏色和風味具有一定的影響。葡萄酒中單寧直接影響了葡萄酒的色澤，風味和陳釀潛力。它也是干紅葡萄酒澀味的重要組成部分[4-5]。陳釀是葡萄酒中水解單寧的主要來源[6]，因此研究葡萄酒中的單寧含量十分重要。紅葡萄酒顏色深度受花色苷影響很大，它是構成干紅葡萄酒感官質量的重要指標之一，也是葡萄酒中抗氧化活性的主要物質之一[7]。色澤直接影響人們對其品質的評價及產品的選擇，挑選具有濃郁色調的葡萄酒便成為消費者購買的重要依據。葡萄果實中的花色苷主要存在于葡萄酒的果皮中。研究表明[8-9]，不同的釀酒酵母發酵干紅葡萄酒中的花色苷，雖然菌種不同存在顯著差異，但是各類花色苷在總花色苷的比例差別不大。但大多數新選酵母依然將其作為一個研究指標。通過測定實驗組已經篩選的本土優良釀酒酵母[10]的發酵品質來判定酵母WJ1和Q12的釀酒可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種來源

Q12酵母菌(分離自山東平度早霞玫瑰葡萄的果實中)、WJ1酵母菌(分離自內蒙古烏海農家的發酵醪液)，由內蒙古農業大學職業技術學院內蒙古教育廳產學研科技創新平臺菌種庫提供；對照菌株為Excellence XR,法國諾蒙集團;CECA、CEC01，安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 實驗試劑

偏重亞硫酸鉀、果膠酶，意大利帝伯仕；NaOH、福林-丹尼斯試液(0.5 g/L標準溶液)、福林-酚試劑(2 mol/L標準溶液)、單寧酸、HCl、H2SO4、Na2CO3、葡萄糖、酚酞、 碘、KI、淀粉、硼酸鈉、CuSO4、次甲基藍(均為分析純)，天津風船化學試劑科技有限公司。

1.1.3 儀器與設備

TARTER3100精密pH計，奧豪斯儀器有限公司;SA2202S-CW電子天平，德國賽多利斯集團;ZDJ-4A全自動電位滴定儀，上海雷磁儀器有限公司;H1全功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司;100L控溫發酵罐，濟南中德發酵設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 梅鹿輒干紅葡萄酒的發酵工藝流程及操作要點

梅鹿輒干紅葡萄酒的發酵工藝流程如下：

選用成熟度良好的梅鹿輒葡萄，去除每串上的生青果粒以及發霉腐爛的果粒，除埂破碎分別加入到15個100 L的發酵罐中，入罐量為80%，加入60 mg/L的偏重亞硫酸鉀，加入30 mg/L的果膠酶，冷浸漬1 d，對照組加入活化的商業酵母200 mg/L，實驗組加入活化的本土酵母液1 mL/L,第1天采用開放式循環2次并壓帽，以后每天采用封閉循化2次并壓帽，直到發酵結束，發酵結束以發酵液比重不再發生變化為止。發酵結束放出自流汁，加入乳酸菌進行蘋乳發酵，蘋乳發酵結束后，冷沉降1周排除酒泥，調硫放入酒窖陳釀10個月，罐瓶得到成品干紅。

1.2.2 土酵母對發酵梅鹿輒的動態影響研究

在發酵罐中依次加活化的酵母菌XR、CEC01、CECA、WJ1、Q12，并標注為CK1、CK2、CK3、A、B，實驗平行測定3次。發酵過程中每天定時進行循環并在循結束測定每個發酵罐的總酸、還原糖、酒精度、丹寧、花色苷、總酚等指標，并在陳釀結束進行感官品評。

1.3 分析方法

1.3.1 總酸的測定

參照魏冬梅等[11]的方法,用自動電位滴法對發酵樣品進行測定,以NaOH為滴定液,采用pH復合電極指示pH變化,根據等電點的突變判斷滴定終點。

1.3.2 還原糖的測定

參照莫允煥等[12]的實驗方法，用電位滴定法測定還原糖含量。

1.3.3 酒精度值的測定

樣品酒精度值測定采用蒸餾法，取發酵樣品100 mL，蒸餾水100 mL置于500 mL圓底燒瓶中，進行冷凝回流蒸餾，收集前100 mL蒸餾液，用酒精計和溫度計分別測定蒸餾液的溫度和酒精度，根據溫度和酒精度參照酒精對照表查出酒精度[13]。

1.3.4 單寧含量的測定

參照李愛華等[14]的試驗方法取2 mL樣品放入2個100 mL容量瓶中蒸餾水定容至100 mL，然后取稀釋后樣品4 mL加入2 mL 蒸餾水和 12 mL 濃HCl。將配置好的樣品分別等量放入2只試管(A、B)并蓋塞密閉，用錫箔紙包嚴避光。試管A：常溫下放置 30 min；試管 B：沸水浴 30 min 后冷至室溫；然后2只試管分別加入1 mL無水乙醇， 酶標儀550 nm出測定試管A及B的樣品波長，試管A的吸光值記為A1，試管B的吸光值記為B1。總單寧含量計算如公式(1)所示：

總單寧含量/(g·L-1)=(B1-A1)×19.33

(1)

1.3.5 總酚及花色苷的測定

參照李愛華等[14]的試驗方法，通過紫外吸收法測定花色苷的含量。福林酚法測定樣品中總酚含量[15]。

1.3.6 感官評價

參照GB 15037—2006葡萄酒感官要求進行評價[16]發酵結束由2位國家二級果露酒品評師、4位國家三級果露酒品評師、1位資深釀酒師、5位果酒發酵研究生，1位發酵實驗員組成品評團進行品評去除一個最高分和一個最低分，得到平均分，然后對菌種進行評價。

1.3.7 數據處理

采用Excel 2007、Graphpad 6.01及SPSS 19.0進行數據分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒過程中總酸含量的動態變化

本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒過程中總酸含量的動態變化如圖1所示。

圖1 本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒過程中總酸含量的動態變化Fig.1 Dynamic changes of total acid in the process of fermenting Merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae

由圖1可知，在發酵過程中總酸變化均呈先上升后下降再上升的變化趨勢。本土酵母與商業對照酵母整體趨勢相同，酒精發酵啟動開始到發酵前6 d，由于葡萄果實壓榨后浸漬和發酵過程中糖含量的減少，琥珀酸、蘋果酸、乙酸含量逐漸增加[17]。發酵6 d左右總酸含量達到最大值。酒精發酵6～12 d，酸度有所下降，因為此階段酒精發酵基本結束，12～15 d時總酸含量稍微上升，主要由于發酵結束后酒石酸氫鉀在葡萄酒中過飽和存在，葡萄酒的酸穩定主要還是與酒石酸氫鉀、酒石酸鈣的沉淀有關[18]。總酸質量濃度一般為5～7.5 g/L[19]，發酵前梅鹿輒葡萄果汁中總酸質量濃度為4.56 g/L，發酵結束后本土釀酒酵母WJ1和Q12總酸均質量濃度分別為6.10和5.98 g/L，商業釀酒酵母總酸均質量濃度為5.93～6.00 g/L。本土釀酒酵母和商業釀酒酵母均滿足發酵標準，且差異性不顯著。

2.2 本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒過程中還原糖含量與酒精度的動態變化

在葡萄酒發酵過程中，酵母利用葡萄果實中的糖轉化為酒精，并利用葡萄原料中糖來完成自身的生長和繁殖。因此，糖含量直接影響酵母菌的繁殖與轉化功能，最終會影響葡萄酒的質量。梅鹿輒葡萄酒發酵過程中還原糖變化如圖2所示。

圖2 本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒過程中還原糖含量的動態變化Fig.2 Dynamic changes of reducing sugar in fermentation of merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae

葡萄酒發酵過程中的糖含量與葡萄酒酒精度呈顯著負相關性[20]，即還原糖含量越少，酒精度含量越高。梅鹿輒葡萄酒酒精度變化結果如圖3所示。

圖3 本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒過程中酒精度的動態變化Fig.3 Dynamic changes of alcohol in the process of fermenting Merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae

由圖2和圖3可知，梅鹿輒葡萄果汁中還原糖質量濃度為204.41 g/L，在發酵0～9 d時，商業釀酒酵母和本土釀酒酵母發酵液中的還原糖含量隨發酵時間的延長而降低，發酵液中的酒精度隨發酵時間延長而增加。在發酵至9 d時，發酵液中的殘糖含量較少為3.33～4.68 g/L，酒精度基本穩定在11.5%vol～12%vol。發酵時間為9～15 d時，發酵液中的還原糖趨于平緩，發酵液中的糖和酒精只有微量變化。經過15 d酒精發酵后，3株商業釀酒酵母發酵液中的還原糖含量為3.28～3.49 g/L，酒精度12.0%vol～12.1%vol，本土釀酒酵母WJ1的酵液中還原糖含量為3.33 g/L，顯著低于對照菌CK1，但與對照菌CK2、CK3差異不顯著。本土釀酒酵母Q12發酵液中還原糖含量為3.57 g/L，高于對照菌CK2、CK3，但與對照菌種CK1差異不顯著，本土釀酒酵母WJ1和Q12酒精度分別為12.2%vol、12%vol，與對照商業菌株差異不顯著。

2.3 本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒過程中單寧含量的動態變化

利用2株本土釀酒酵母和3株對照菌株進行梅鹿輒葡萄酒發酵，發酵過程中單寧動態變化如圖4所示。

圖4 本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒過程中單寧含量的動態變化Fig.4 Dynamic changes of tannin in the process of fermenting Merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae

由圖4可知，單寧含量在發酵過程中含量隨發酵時間的延長而增加，是由于果實單寧含量被浸出加速單寧釋放[21]。梅鹿輒果汁中單寧質量濃度62.51 g/L。酒精發酵過程中，單寧含量迅速增加，酒精發酵結束時，單寧含量達到最大，且本土釀酒酵母與商業菌株趨勢相似。發酵結束后，本土釀酒酵母WJ1和Q12單寧質量濃度分別為175.14、169.24 mg/L。商業釀酒酵母單寧質量濃度在159.25～194.67 mg/L，WJ1單寧含量顯著高于對照菌株CK1，顯著低于CK3，與CK2差異不顯著。Q12單寧含量高于CK1低于CK2、CK3，且差異顯著。酵母產生的乙醛可參與形成花青素-乙醛-黃烷-3-醇衍生物，酵母發酵可加速果皮細胞壁分解作用，有利于改善葡萄酒的苦味、澀味和酒的顏色[22]。

2.4 本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒過程中花色苷含量的動態變化

花色苷主要存在于植物的細胞液中，是由花色素和葡萄糖以糖苷鍵結合形成的糖苷，使莖、葉、花和果實具有不同的顏色，因此對紅葡萄顏色的影響較大。它也是葡萄酒中抗氧化活性的主要物質之一。梅鹿輒葡萄酒發酵過程中花色苷含量變化規律如圖5所示。

圖5 本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒過程中花色苷含量的動態變化Fig.5 Dynamic changes of anthocyanins in the process of fermenting Merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae

由圖5可知，在0～9 d，發酵液中花色苷含量隨發酵時間的延長而增加。由于葡萄皮中的花色苷類物質在發酵前期被大量浸出，花色苷大幅度增加[23]。在酒精發酵過程中，不同種類的酵母也影響葡萄酒的組成。例如，酵母釋放的甘露糖蛋白加速單寧與花青素反應并增加了總花色苷含量。發酵第9天時，花色苷含量均到達最大值。WJ1Q12發酵的梅鹿輒葡萄酒中花色苷最大值分別為175.54、182.35 mg/L。商業釀酒酵母發酵液中花色苷質量濃度為174.34～184.36 mg/L，本土釀酒酵母的發酵液中花色苷含量介于商業釀酒酵母發酵液花色苷含量的范圍內，且差異不顯著。而酒精發酵基本結束后的9～15 d花色苷含量隨發酵時間的延長而下降。因為花色苷為天然食用色素，穩定性不高，容易被氧化和分解。發酵結束后，對照菌株發酵液中花色苷質量濃度為134.35～156.30 mg/L，本土釀酒酵母WJ1、Q12發酵液中花色苷質量濃度為148.29、128.25 mg/L，WJ1發酵液中的花色苷含量高于CK1發酵液中的花色苷質量濃度，低于CK2、CK3中發酵液的含量，且差異顯著，而Q12菌株發酵液中花色苷含量均低于對照菌株且差異顯著。

2.5 本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒過程中總酚含量的動態變化

本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒過程中總酚含量的動態變化如圖6所示。

圖6 本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒過程中總酚含量的動態變化Fig.6 Dynamic changes of total phenol in the process of fermentation of merlot wine by native Saccharomyces cerevisiae

由圖6可知，不同釀酒酵母發酵液中的總酚在發酵過程中均呈逐漸上升的趨勢。葡萄中大量的酚類物質存在于果皮和果梗中。葡萄與葡萄酒中的總酚，是葡萄與葡萄酒中多酚類物質的總量[24]。葡萄發酵的浸漬過程使大量的多酚類物質進入葡萄酒[25]。影響葡萄顏色的主要因素是酚類物質中的花青素，單寧也是葡萄中多酚物質的主要成分。由于花色苷和單寧在動態變化中呈逐漸上升的趨勢，總酚在發酵過程中也呈上升的趨勢。梅鹿輒果實中總酚質量濃度916.64 mg/L。發酵結束后，本土釀酒酵母WJ1和Q12發酵液中的總酚質量濃度分別為2 070.78、2 063.12 mg/L，WJ1和Q12總酚質量濃度差異不顯著，但均高于商業酵母CK1，低于商業酵母CK2、CK3，且差異顯著。商業釀酒酵母發酵液中的總酚質量濃度為2 001.76～2 274.00 mg/L，本土釀酒酵母總酚含量均在商業釀酒酵母總酚含量范圍內，具有較好的釀造學品質特性。

2.6 本土釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄酒的感官評價

感官評價結果如圖7所示。本土釀酒酵母WJ1發酵的梅鹿輒葡萄酒13位專業人員平均得分78分，色澤與典型梅鹿輒葡萄酒色澤相近，略透明，具典型果香、酒香但略微不足，酸澀感較重，口感不夠柔順，酒體結構感一般；Q12平均得分為68分，顏色與典型梅鹿輒葡萄酒色澤不符，略失光澤，果香不足，回味較短，酒體寡淡，酒體欠平衡，粗糙；商業釀酒酵母中CK1經13位專業人員評價后平均得分最高為89分，色澤呈現紫紅色，有光澤，有明顯的果香和花香，香氣醇香濃郁，結構感強，優雅，余味持續時間長，典型性突出；CK2發酵的梅鹿輒葡萄酒5位專業人員平均得分86分，色澤與典型梅鹿輒葡萄酒色澤相符，沒有懸浮物，透明，酒體豐滿，較CK1釀酒酵母相比，香氣略微遜色，酸澀味適中，苦味微淡，典型性明顯；商業釀酒酵母CK3發酵的梅鹿輒葡萄酒平均分為73分，葡萄酒顏色較淺，渾濁，略失光，香氣寡淡，回味較短，酒體不協調。

圖7 本土釀酒酵母與商業釀酒酵母發酵干紅的感官評定對照Fig.7 Comparison of sensory evaluation of dry red fermented by local and commercial Saccharomyces cerevisiae注：圖中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

結合感官評價結果，梅鹿輒葡萄酒的色澤、香氣、口感和典型性都受到不同釀酒酵母的影響，本土釀酒酵母WJ1和Q12與對照菌株CK1、CK2、CK3發酵的梅鹿輒葡萄酒比較發現，本土釀酒酵母WJ1發酵液具典型果香、酒香但略微不足，酸澀味略重，不柔和，酒體結構一般，但澄清度、色澤、香氣優于商業釀酒酵母CK2發酵液。本土釀酒酵母Q12發酵梅鹿輒葡萄酒的澄清度、香氣、滋味和典型性都不及商業釀酒酵母，色澤受釀酒酵母甘露糖蛋白對酚類物質的影響，發酵香是酵母菌代謝的副產物，這與釀酒酵母的發酵能力有重要的關系，口感是香氣、酸、澀、苦等滋味的綜合評價結果[26-27]。綜上所述，本土釀酒酵母WJ1可作為商業酵母用于發酵梅鹿輒葡萄酒，而Q12有待于進一步開發。

3 結論

通過采用本土釀酒酵母與商業釀酒酵母發酵梅鹿輒干紅葡萄酒并測定發酵過程及終點的總酸、殘糖、酒精度、花色苷、單寧和總酚含量，及發酵結束感官評價。結果顯示，在梅鹿輒葡萄酒發酵過程中，本土釀酒酵母WJ1發酵液總酸和酒精度含量略高，但與商業酵母無太大差別；Q12發酵液中還原糖含量略高于商業釀酒酵母發酵液，花色苷含量略低，其他指標與商業釀酒酵母發酵液無太大差別，本土釀酒酵母WJ1發酵液具典型果香、酒香但略微不足，酸澀味略重，不柔和，酒體結構一般，但澄清度、色澤、香氣優于商業釀酒酵母CECA發酵液。本土釀酒酵母Q12色澤與典型梅鹿輒葡萄酒色澤不符，略失光澤，果香不足，回味較短，酒體寡淡，酒體欠平衡，粗糙，澄清度、香氣、滋味和典型性都不及商業釀酒酵母。通過與商業菌株對比研究得到的2株本土酵母Q12、WJ1，經過后期馴化有望為我國葡萄酒釀造提供新的本土菌種，同時為本土釀酒酵母多樣性研究提供理論依據。