優化頂空固相微萃取/氣相色譜-質譜聯用方法測定蜂王漿揮發性化合物

王嬌，李玉新，趙保堂，何興芬，張俊，張兆云，楊富民*

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州， 730070)2(甘肅省農業科學院 農產品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州，730070)

蜂王漿是一種淡黃色的乳脂狀物質，略帶刺激性氣味[1]。蜂王漿是由年輕工蜂(ApismelliferaL.)的下咽和下頜腺分泌的一種微酸性(pH 3.5～4.5)物質。新鮮蜂王漿含水(50%～65%)、蛋白質(11%～18%)、碳水化合物(10%～15%)、脂肪酸和脂質(4%～8%)、礦物質鹽(約1.5%)以及少量的多酚和維生素[2]。有關蜂王漿的特性、營養功能及用途已有大量報道，但不同來源蜂王漿的揮發性化合物組成和含量測定報道很少。中國是蜂王漿生產及出口大國，蜂王漿揮發性化合物的研究將有助于蜂王漿進一步利用。

天然食品的風味和香氣很大程度上取決于基質和頂空中的揮發性化合物[3]。揮發性化合物的提取目前有同時蒸餾、動態頂空、靜態頂空、超聲波輔助提取以及蒸汽蒸餾、溶劑萃取、固相微萃取等。頂空固相微萃取(headspace-solid phase microextraction，HS-SPME)是一種快速無溶劑分離技術，其主要優點是簡單、靈敏度高、需要的樣品量少，可與氣相色譜、氣相色譜-質譜和高效液相色譜聯用[4]。ISIDOROV等[5]采用HS-SPME從蜂王漿中分離出了25種揮發性化合物，其中最豐富的是2-庚酮、2-壬酮、苯甲醛和辛酸,將蜂王漿樣品在-18 ℃和4 ℃下儲存10個月，其揮發性化合物的成分基本不變;但在室溫下儲存10個月，苯酚的含量為原來的50%。ZHAO等[6]分析了10個不同開花季節的蜂王漿樣品，發現蜂王漿揮發性化合物中富含酸、酯和醛類化合物，如乙酸、苯甲酸甲酯、己酸和辛酸等。對蜂王漿揮發性化合物進行分析，可能有助于確定其來源、質量和新鮮度。

揮發性有機化合物的分析受提取和檢測技術的影響[7]，不同特性的原料萃取方法不同，不同來源蜂王漿其揮發性化合物含量不同，其差異有助于質量評價。本研究采用HS-SPME方法對其萃取溫度、萃取時間、樣品量、加鹽量在單因素試驗的基礎上，采用響應面設計優化試驗，旨在確定蜂王漿揮發性化合物的最佳提取條件，為準確測定奠定基礎；通過對不同來源蜂王漿中揮發性化合物的檢測，揭示之間的差異，為其品質評定及加工利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：蜂王漿A采自寧夏固原市涇源縣，蜂王漿B、C、D、E 購自市售4個不同品牌的產品。

試劑：色譜級正己烷，成都科隆化工有限公司；2-甲基-3-庚酮，Shymax Chemicals 有限公司；C7-C30系列烷烴，Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

三重四級桿氣相色譜-質譜聯用儀7000D(配有EI離子源和NIST MS數據處理系統)，美國Agilent公司；DF-101S集熱式磁力攪拌器，常州市瑞華儀器制造有限公司；VF-WAXms毛細管柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)，美國Agilent公司；手動固相微萃取裝置、50/30μm DVB/CAR/PDMS 萃取纖維頭，美國Supelco公司；微量進樣器(1 μL)，上海安亭微量進樣器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 蜂王漿揮發性化合物的提取

參照任佳淼等[8]方法略作修改，準確稱取2 g蜂王漿樣品置于20 mL頂空瓶內，加入轉子密封，在預先設置好溫度的加熱磁力攪拌器上平衡30 min。將SPME萃取頭插入頂空瓶中，推出纖維頭后吸附50 min，萃取結束后，在250 ℃的GC-MS進樣口解吸10 min。

1.3.2 氣相色譜條件

毛細管色譜柱VF-WAXms(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫到200 ℃，再以10 ℃/min升溫至240 ℃，保持8 min。進樣口溫度250 ℃，載氣為He，流速1 mL/min，不分流。

1.3.3 質譜條件

電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線和四級桿溫度分別為250 ℃和150 ℃，掃描質量范圍m/z29～600。

1.3.2 單因素試驗設計

按照1.3.1的方法，在樣品量為2 g、萃取溫度為60 ℃、萃取時間50 min、飽和NaCl用量2 mL、平衡30 min、解析10 min的基礎條件下，保持其他條件不變，分別設置萃取溫度40、50、60、70、80 ℃，萃取時間30、40、50、60、70 min，樣品用量1、1.5、2、2.5、3 g，飽和NaCl 溶液用量0、1、2、3、4 mL，以總峰面積為指標進行單因素優化試驗，每個試驗重復3次。

1.3.3 Box-Behnken 響應面試驗

依據單因素試驗結果，選取萃取溫度(X1)、萃取時間(X2)、樣品量(X3)、飽和NaCl溶液用量(X4)為影響因素，以總峰面積為響應值，做4因素3水平響應面試驗，設計如表1所示。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken analysis

1.4 蜂王漿揮發性化合物的測定

采用試驗所優化的條件，將蜂王漿置于20 mL頂空瓶中，加入1 μL的內標(2-甲基-3-庚酮，8.16 μg/μL，正己烷溶液溶解)，磁力攪拌平衡30 min，SPME萃取60 min，250 ℃ GC-MS進樣口解吸10 min, 溶劑延遲4 min。氣相色譜及質譜條件同1.3.2和1.3.3。

1.5 定性定量分析

定性分析：檢索NIST MS數據庫比對目標化合物，進行定性分析；采用相同條件對正構系列烷烴(C7～C30)進行GC-MS分析，利用色譜峰的保留時間計算目標相應化合物的保留指數，并與在數據庫中查詢的RI值比對(認定范圍為相差0～100)，實現化合物的輔助定性。色譜峰保留指數計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ta為色譜峰a的保留時間，tn為正構烷烴Cn的保留時間(色譜峰a的保留時間須在正構烷烴Cn和Cn+1之間)。

定量分析：根據蜂王漿樣品中添加的內標化合物含量、內標化合物色譜峰面積及目標化合物色譜峰面積，計算目標化合物的含量，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：CX為目標化合物的質量濃度，CA為內標的質量濃度，SX為目標化合物的峰面積，SA為內標的峰面積。

1.6 統計分析

數據采用 SPSS 25.0 軟件進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 萃取單因素試驗

由圖1-a可見，萃取溫度40～60 ℃，隨著溫度上升，總峰面積不斷增大，60 ℃時達到最大值，之后稍有下降，70 ℃與80 ℃的總峰面積無顯著差異。因此，宜選擇60 ℃作為萃取溫度。圖1-b表明，萃取時間為30～60 min，隨時間延長，總峰面積不斷增大，60 min時，總峰面積最大，之后開始減小，其原因可能是隨著萃取時間的延長部分物質會從萃取頭上解析下來，進而造成總峰面積的降低。由圖1-c可以看出，樣品量對總峰面積的影響呈現出先增大再減小的趨勢。在2 g時總峰面積最大，其原因可能是因為樣品量少，吸附物的量小；樣品量過大，頂空體積變小，影響吸附效果。添加適宜鹽可以提高極性化合物和揮發性化合物的提取效率[9]。由圖1-d可知，飽和NaCl溶液的添加量在1 mL時，總峰面積最大，表明蜂王漿萃取適宜的鹽添加為飽和NaCl溶液1 mL。

a-萃取溫度;b-萃取時間;c-樣品量;d-飽和NaCl添加量圖1 單因素試驗結果Fig.1 Single-factor test results

2.2 響應曲面優化試驗

利用Design Expert軟件，對表2的數據進行二次多項式回歸擬合，以色譜總峰面積為響應值，得到二次多元回歸方程如下：

表2 響應面設計及結果Table 2 Response surface design and results

表3 二次回歸方程模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the quadratic regression model

圖2 響應面三維分析圖Fig.2 Response surface 3D analysis chart

Expert-design軟件預測的萃取條件條件為萃取溫度61.91 ℃，萃取時間59.99 min，樣品量2.02 g，飽和NaCl溶液添加量為0.92 mL，總峰面積的預測值為3.310 11×1010。考慮到試驗的實際操作情況，將萃取條件優化為萃取溫度62 ℃，萃取時間60 min，樣品量2 g，飽和NaCl溶液的添加量為1 mL，在此條件下進行3次驗證試驗，得到總峰面積的平均值為3.247 99×1010，試驗值與預測值基本吻合。

2.3 蜂王漿揮發性風味物質測定

圖3為樣品A的總離子流圖，其余樣品與樣品A基本相似。由圖3可知，色譜條件適合HS-SPME萃取的蜂王漿揮發性化合物測定，色譜峰完全分離，很少重疊，分離效果好。

由表4可看出，5個蜂王漿樣品中共檢出48種化合物，其中酸類15種、酯類12種、醛類5種、醇類5種、酮類4種、酚類2種、其他5種；33種化合物是通過保留指數和NIST MS數據庫的雙重定性，結果較為可靠。就含量而言，不同蜂王漿樣品中單一揮發性化合物的含量范圍為0.09～17.48 μg/μL。辛酸在蜂王漿的揮發性化合物中含量最高，其次是反式-2-癸烯酸、苯甲醛、(E)-2-辛烯酸、2-壬酮、己酸、2-庚酮等。

圖3 樣品A的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of volatile components in sample A

表4 蜂王漿樣品中揮發性化合物的定性和定量分析 單位：μg/μLTable 4 Qualitative and quantitative analysis of volatile compounds in royal jelly samples

續表4

注：同一行不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05);--表示未檢出或未檢索到

由圖4可知，5個蜂王漿樣品中揮發性化合物含量較高的是酸類、酯類、醛類和酮類，其中酸類遠高于其他類別。不同樣品間，A樣品酸類、醛類、酮類和其他類的含量最高，分別為(26.16±0.43)、(3.37±0.03)、(5.45±0.08)、(1.16±0.01) μg/μL；B樣品除酯類和其他類外，均低于其他樣品；C樣品醇類和酚類最高；D樣品酯類最高，其他類未檢出；E樣品除酯類、醇類、其他類低于其他樣品外，其余類別高低不一。不同來源蜂王漿揮發性化合物種類含量的不同，可能與蜜源、新鮮度及貯藏條件有關。

圖4 不同蜂王漿中各類揮發性化合物的含量變化Fig.4 Contents of various volatile components of different royal jelly samples

3 討論

HS-SPME是從固體或液體樣品的頂部空間中提取揮發性化合物到涂覆有聚合物相的萃取纖維頭上。因此，HS-SPME萃取條件會影響其分析的靈敏度和準確性[10]。由于HS-SPME的機理是建立在三相分析物(纖維涂層、頂空、樣品)之間平衡的基礎上，因此HS-SPME對頂空揮發性化合物的分析在很大程度上受到小瓶中揮發性化合物蒸氣壓的影響。據報道，影響蒸氣壓力和頂部空間中揮發性成分平衡的主要變量是萃取溫度、平衡時間和萃取時間[11-12]。添加NaCl用于揮發物的提取，主要是利用鹽析效應增加分析物進入頂空及纖維涂層的量[13]。因此，可以通過優化所涉及的參數來獲得靈敏度和萃取率之間平衡良好的方法[14]。

基于試驗獲得的蜂王漿揮發性性化合物的萃取條件，檢測出了符合條件的48種物質，酸類物質和酯類占比最高，分別是31%、25%。其次為醛類、醇類各占10%、酮類8%。揮發性化合物對香氣及某些成分的味道有著很大的影響[15-16]，5個樣品中酸類物質最多，含量也最高，這與蜂王漿自身的酸味相吻合。5個樣品中共有的化合物有16種，如辛酸、己酸、苯甲醛、苯酚和苯甲酸甲酯等，這些共有化合物可能與蜂王漿的特征風味有關。

4 結論

蜂王漿組成與特性顯著不同于其他食品原料，其揮發性化合物的提取需要依據其特性采用適宜的方法及條件。采用HS-SPME方法，在萃取溫度62 ℃、萃取時間60 min、樣品量2 g、飽和NaCl溶液的添加量為1 mL的條件下，總峰面積的平均值可達到3.247 99×1010，提取分離效果好。不同蜂王漿因蜜蜂品種、蜜源等條件不同，揮發性化合物存在差異，但其共有的辛酸、己酸、苯甲醛、苯酚和苯甲酸甲酯等可能與蜂王漿的特征風味有關。本實驗僅測定了5個不同樣品的揮發性化合物，應對不同蜜源、不同貯存條件的蜂王漿進行進一步的測定，揮發性化合物的測定有助于評價蜂王漿的新鮮度，而對貯存條件、方式、時間等方面進行深入研究將是未來蜂王漿揮發性物質的研究方向之一。