基于超快速液相色譜-質譜聯用技術檢測藥食兩用 薄荷中氨基酸和核苷類成分

孫慧娟，王瑞，宋芊芊，周慧銀，方成武，2*

1(安徽中醫藥大學 藥學院，安徽 合肥,230012)2(安徽省中醫藥科學院亳州中醫藥研究所，安徽 亳州,236800)

薄荷是唇形科薄荷屬多年生草本植物，藥食兩用植物。具有利咽、透疹等功效，用于咽喉腫痛及小兒麻疹等癥[1-3]?，F代藥理研究表明，薄荷能夠抗腫瘤、抗菌、消炎、有效緩解鎮痛[4-7]。薄荷的藥用價值很高，其營養成分也十分豐富，富含氨基酸、有機元素、維生素等多種營養成分，具有重要的營養價值和保健價值[8-10]。

目前，對于薄荷研究多以揮發油類成分為主[11-13]，而作為一種藥食兩用的植物，薄荷作為常見的茶飲，其實際運用中不僅僅局限于揮發油, 其氨基酸和核苷類成分同樣重要。而對薄荷中氨基酸、核苷類成分的研究較少，其營養價值尚未得到充分認識。氨基酸主要以游離及水解的形式存在于植物體內，氨基酸檢測方法主要包括高效液相色譜法[14]、毛細管電泳法[15]、離子交換色譜法等[16]。本試驗通過超快速液相色譜-質譜聯用技術(ultra-fast liquid chromatography-mass spectrometry,UFLC-MS/MS)，建立同時測定薄荷中21種氨基酸和10種核苷類成分含量方法，對3個不同產地的薄荷中氨基酸和核苷類成分差異進行分析比較，并應用PCA[17]和TOPSIS[18]方法對樣品進行綜合評價，為藥食兩用薄荷的質量評價和綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Trip Quad 4500串聯四級桿質譜儀，美國 ABSciex公司；ExionLC AD 超快速液相色譜儀，日本Shimadzu公司；KQ-400KDE型高功率數控超聲清洗器(100 kHz)，昆山市超聲儀器有限公司；離心機(HC-3018)，安徽中科中佳科學儀器有限公司；SArtorius BT125D十萬分之一電子天平,德國賽多利斯公司；ME36S 型百萬分之一電子天平,德國賽多利斯公司；LGJ-10真空冷凍干燥機,北京松源華興科技發展有限公司；Milli-Q超純水系統,Millipore公司；0.22 μm 微孔濾膜,津騰，中國天津。

1.2 材料與試劑

異亮氨酸(Ile)、組氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)、絡氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、蘇氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)11種氨基酸，均購于中國藥品生物制品檢定所，批號為140624-200805。天冬氨酸(Asp，批號B21934)、天冬酰胺(Asn，批號B21935)、絲氨酸(Ser，批號140688)、甘氨酸(Gly，批號B21915)、纈氨酸(Val，批號140681)、精氨酸(Arg，批號B21920)、羥基脯氨酸(Hpro，批號B21928)、色氨酸(Tryptophan，批號140677)、鹽酸賴氨酸(Lysine，批號140693)、γ-氨基丁酸(GABA，批號B21979)、尿嘧啶(Uracil，批號B20908)、腺嘌呤(Adenine，批號B21357)、胞苷(Cytidine，批號B20073)、肌苷(Inosine，批號B20582)、胸苷(Thymidine，批號B21915)、鳥苷(Guanine，批號B20905)、腺苷(Adenosine，批號B21356)、尿苷(Uridine，批號B20907)、次黃嘌呤(Hypoxanthine，批號B20211)、鳥嘌呤(Guanine，批號B20906)，均購于上海源葉生物科技有限公司，質量分數均大于98%。水為超純水；乙腈、甲酸為質譜純，德國Merck公司；其余試劑為分析純。

試驗所研究的樣品，采集于3個不同產地的薄荷植物新鮮葉片，經安徽中醫藥大學方成武教授鑒定為唇形科植物薄荷MenthahaplocalyxBriq.的干燥地上部分。樣品信息如表1所示。

表1 薄荷主輔料樣品來源及基本信息Table 1 Source and basic information of main products of mint steamed vegetables

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

Waters XBridge Amide專用柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm)；流動相∶水(含0.2%甲酸)(A)-乙腈(含0.2%甲酸)(B)，梯度洗脫(0～2.5 min，15% A；2.5～5 min，15%～50% A；5～7 min，50% A；7～8 min，50%～15% A；8～11 min，15% A)；柱溫 30 ℃，流速0.2 mL/min，進樣量1 μL。其正離子多反映監測色譜圖見圖1。

圖1 21種氨基酸和10種核苷的MRM圖Fig.1 UFLC-MS/MS multiple-reaction monitoring(MRM) chromatograms of 21 amino acids and 10 nucleosides

1.3.2 質譜條件

離子化模式ESI+下，采取多反應監測(MRM)檢測；噴霧電壓5.5 kV；離子化溫度550 ℃；氣簾氣為241.3 kPa(35 psi)，Gas1為379.2 kPa(55 psi)，Gas2 為379.2 kPa(55 psi)；同時對碰撞電壓、去簇電壓和檢測離子對進行優化。31種目標成分的優化質譜檢測條件參數見表2。

表2 31種目標成分的優化質譜檢測條件參數Table 2 Optimized MS/MS spectrometry detection condition parameters of 31 target components

1.3.3 溶液制備

1.3.3.1 對照品溶液制備

精密稱取天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、精氨酸、組氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、羥脯氨酸、脯氨酸、色氨酸、γ-氨基丁酸、鹽酸賴氨酸、尿嘧啶、腺嘌呤、胞苷、肌苷、鳥苷、胸苷、腺苷、尿苷、鳥嘌呤、次黃嘌呤對照品適量，分別置25 mL容量瓶中，加超純水配制成0.16、0.18、0.12、0.12、0.14、0.13、0.11、0.14、0.18、0.12、0.13、0.13、0.13、0.12、0.11、0.15、0.13、0.11、0.17、0.17、0.15、0.17、0.13、0.11、0.15、0.12、0.15、0.16、0.11、0.13、0.13 mg/mL的對照品儲備液。取各對照品儲備液適量，加水配制成混合對照品溶液，逐級稀釋，得到一系列不同質量濃度的混合對照品溶液，于4 ℃保存備用。

1.3.3.2 供試品溶液的配制

稱取鮮品薄荷葉500 g，用水清洗干凈，均勻鋪散在托盤上，覆蓋上已扎孔的薄膜，置于-20℃冰箱預凍，隨后將其置于真空冷凍干燥機[19-21]，直至水分含量達到8%以下，即干燥完成。取薄荷粉末(過40目篩)1.000 g，置于100 mL容量瓶中，加入20 mL超純水，室溫超聲處理(100 kHz)提取30 min，吸取上清液于4 500 r/min轉速下離心10 min，過0.22 μm 微孔濾膜，供分析。

1.3.4 線性關系考察、檢測限和定量限

精密吸取“1.3.3”項下不同濃度系列對照品溶液及混合對照品儲備液各1 μL，按照“1.3.1”和“1.3.2”項下色譜-質譜條件進樣測定，以對照品的峰面積積分值(Y)為縱坐標，對照品的質量濃度(X)為橫坐標，得出回歸方程、相關系數(r)、線性范圍。以信噪比(S/N)約為3 計算各成分的檢測限(LOD)，以信噪比(S/N)約為10，計算各成分的定量限(LOQ)，結果見表3。

1.3.5 方法學考察

1.3.5.1 精密度試驗

精密吸取一定濃度的混合對照品溶液，按照“1.3.1”和“1.3.2”項下色譜-質譜條件連續進樣6次，得出21種氨基酸和10種核苷對照品峰面積的RSD在0.20%～3.36%。具體數據見表4。

1.3.5.2 重復性試驗

精密稱取S5—薄荷樣品6份，每份1.000 g，按照“1.3.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”和“1.3.2”項下色譜-質譜條件進樣測定，計算21種氨基酸和10種核苷的質量分數的RSD在0.21%～3.60%。具體數據見表4。

表3 21種氨基酸和10種核苷的線性關系考察Table 3 Investigation of liner relationship of 20 amino acids and 10 nucleosides

1.3.5.3 穩定性試驗

取S5—薄荷樣品的供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12、24 h時按照“1.3.1”和“1.3.2”項下色譜-質譜條件下進樣分析，測定21種氨基酸和10種核苷成分峰面積的RSD值，RSD在0.65%～3.84%。具體數據見表4。

1.3.5.4 加樣回收率試驗

精密稱取S5—薄荷樣品6份，每份1.000 g，分別加入與1.000 g樣品中各待測成分含量相當的對照品，按照“1.3.3.2”項下方法制備加樣回收供試品溶液，按照“1.3.1”和“1.3.2”項下色譜-質譜條件下進樣測定，計算加樣回收率和相對標準偏差，結果見表4。31種成分的平均加樣回收率在94.18%～98.76%，相對標準偏差在1.17%～3.56%。

表4 21種氨基酸和10種核苷方法學考察 單位：%Table 4 Methodological study of 21 amino acids and 10 nucleosides

2 結果與分析

2.1 樣品測定結果

按照“1.3.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”和“1.3.2”項下色譜-質譜條件進樣得相應的峰面積，根據對應的標準曲線計算出供試樣品中21種氨基酸和10種核苷類成分的含量，結果見表5。

表5 薄荷中21種氨基酸和10種核苷的含量測定結果 單位：μg/gTable 5 Determination results of 21 amino acids and 10 nucleosides in peppermint

2.2 主成分(PCA)分析

由于薄荷樣品中各成分在量綱和數量級上存在較大差異，為更好地分析結果，將原始數據進行標準化處理后，對21種氨基酸和10種核苷含量分別應用SPSS 23.0軟件進行主成分(PCA)分析。以特征值大于1，累積貢獻率大于70%為提取標準。

提取了PCA初始因子載荷矩陣，因子載荷矩陣主要說明主成分在各變量上的載荷，載荷越高，越相關。在氨基酸中，甘氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、γ-氨基丁酸在PC1上有較高的載荷，說明PC1能反映這5種氨基酸的信息；同理，PC2能反映脯氨酸、丙氨酸的信息。在核苷中，尿嘧啶、腺嘌呤、胞苷、尿苷、鳥嘌呤在PC1上有較高的載荷，說明PC1能反映這5種核苷成分的信息；同理，PC2能反映胸苷的信息。綜上，不同產地薄荷的氨基酸類成分中，甘氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、γ-氨基丁酸、脯氨酸、丙氨酸為主要成分；同理，在核苷類成分中，尿嘧啶、腺嘌呤、胞苷、尿苷、鳥嘌呤、胸苷為主要成分。

2.3 TOPSIS分析

分別以氨基酸和核苷類成分以及總成分含量為分析指標，采樣TOPSIS分析方法對6份樣品進行綜合分析，得出排序結果。

2.3.1 歸一化處理

將6份樣品中 21種氨基酸和 10種核苷成分的含量數據矩陣分別進行歸一化處理，并建立相應矩陣，計算α值，如公式(1)所示：

(1)

式中：αij表示第i個評價對象在第j個指標上歸一化處理后的取值，Xij表示第i個評價對象在第j個指標上的取值。

2.3.2 最優與最劣方案

根據歸一化處理后的樣本情況，得到最優(Z+)和最劣(Z-)值向量。

2.3.3 相對貼近度(Ci)的計算

相對貼近度根據公式(2)計算：

(2)

2.3.4 TOPSIS分析結果

按照Ci大小將各評價對象排序，Ci值越大，表示綜合品質越好。6份樣品中 21種氨基酸和 10種核苷類成分 TOPSIS 分析結果見表6。

結果表明，以氨基酸為分析指標，S4樣品最佳；以核苷為分析指標，S2樣品最高；以總成分為分析指標，S1樣品最高。

表6 6份樣品中21種氨基酸和10種核苷類成分TOPSIS分析結果Table 6 Results of TOPSIS analysis of 21 amino acids and 10 nucleosides in 11 samples

3 討論

各產地樣品在氨基酸和核苷酸樣品的組成和比例均存在一定差異。從總氨基酸含量來看，亳州產樣品總氨基酸含量高達48 337.11 μg/g，阜陽次之，商丘最低。氨基酸成分以谷氨酸平均含量最高(22 710.19 μg/g)，天冬酰胺、組氨酸、羥脯氨酸、天冬氨酸等含量次之，脯氨酸平均含量最低(5.28 μg/g)。從核苷酸總量來看，阜陽產樣品總核苷含量為2 309.02 μg/g，亳州次之，商丘最低。核苷類成分以鳥嘌呤平均含量最高(12 677.08 μg/g)，尿嘧啶、胞苷等次之，腺苷平均含量最低(0.83 μg/g)。由此說明產區環境生態因子對薄荷中氨基酸和核苷類成分的合成積累影響較大。TOPSIS綜合分析結果顯示, 就總成分而言, S1(安徽阜陽) 樣品薄荷相對較優。

本試驗建立了UFLC-MS/MS同時測定3個不同產地薄荷中21種氨基酸和10種核苷含量的方法，比較了不同產地對薄荷中氨基酸和核苷類成分的影響，綜合評價顯示，阜陽產薄荷的綜合質量最優，亳州其次，商丘綜合質量最差。通過PCA和TOPSIS對藥食兩用薄荷質量進行評價，為優選薄荷最優產地提供理論依據，同時為進一步探索評價藥食兩用薄荷的內在質量與控制提供依據及新的質量綜合評價參考方法。