2000—2019年廣西狂犬病病毒流行株的基因組遺傳穩定性分析

覃晴 梁星雪 曹晗 韋顯凱 梁晶晶 李曉寧 羅廷榮

摘要：【目的】揭示廣西狂犬病病毒（RABV）的流行變異規律及進化特征，為廣西狂犬病防控提供科學依據。【方法】對2018年從患狂犬病家犬腦組織分離獲得的2株RABV野毒株（GXYZ2018和GXSL2018）進行全基因組擴增與測序，測序結果采用SeqMan進行拼接以獲得全基因組序列，并與近20年來的RABV廣西流行株進行系統地遺傳變異分析。【結果】GXSL2018株和GXYZ2018株的全基因組序列長度均為11923 bp，不同RABV廣西流行株間的核苷酸序列同源性在87.1%～99.4%，而2株毒株間的同源性為99.1%;與其他RABV廣西流行株相比，GXSL2018株和GXYZ2018株的3'-UTR為69 bp，且在第20位缺失一個核苷酸。基于N基因和G基因核苷酸序列同源性構建的遺傳進化樹均顯示GXSL2018株和GXYZ2018株同屬于Group II型毒株，且2株毒株N蛋白上的B細胞表面抗原表位（第358～367位氨基酸殘基）、Th細胞表位（第404～418位氨基酸殘基）和RNA結合域（第298～352位氨基酸殘基），以及G蛋白上與病毒毒力密切關聯的第333、336、339和357位氨基酸殘基及中和抗體相關表位和受體結合位點均高度保守。【結論】GXYZ2018株和GXSL2018株同屬于Group II型毒株，與近20年來的RABV廣西流行株高度相似，病毒蛋白主要功能區的氨基酸序列高度保守，尚未發生變異，全基因組遺傳特性穩定。

關鍵詞： 狂犬病病毒（RABV）;基因組;遺傳穩定性;Group II型毒株

0 引言

【研究意義】狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的一種人畜共患傳染病，具有高致死率。RABV主要侵害動物和人類的神經系統，通常是經受感染的動物咬傷傳播（陳芳芳，2013;徐素萍等，2018）。廣西是我國狂犬病主要疫區之一，每年因狂犬病死亡的人數居全國首位，且主要發生在鄉村地區。雖然經過近年來的病原監測及家犬免疫接種，狂犬病疫情得到明顯控制，但其引起的公共衛生問題仍不容小覷。【前人研究進展】RABV是一種高度噬神經性的單股負鏈RNA病毒，隸屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒屬（Lyssavirus）（周松峰等，2011;譚業平等，2018），其病毒蛋白包括核蛋白（N）、非酶促聚合酶輔因子磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、糖蛋白（G）和病毒RNA聚合酶蛋白（L）（Liu et al.，2017）。由RNA、N蛋白、P蛋白及L蛋白共同組成的核糖核蛋白復合體（Ribonucleoprotein，RNP）是RABV轉錄和復制的核心組分（Jackson，2011）。P蛋白對機體免疫系統具有拮抗作用，Vidy等（2007）研究發現P蛋白能拮抗Ⅰ型干擾素的轉錄，通過阻斷信號分子STAT1與干擾素基因啟動子結合的方式發揮作用。L蛋白是一種多功能酶，既具備RNA依賴的RNA聚合酶活性（RNA dependent RNA polymerase，RDRP），又具有mRNA加帽酶作用，已有研究發現突變L蛋白攜帶的關鍵甲基化位點，能顯著降低RABV對小鼠的致病性（Tian et al.，2015;王朝等，2017）。在RABV復制過程中，M蛋白可通過招募RNP使其固定于細胞膜，而有利于病毒出芽（彭嬌嬌等，2016）。G蛋白是RABV與宿主細胞結合的配體，對病毒毒力及致病性起關鍵作用（楊健等，2012），已有研究證實將Flury株G蛋白的第333位氨基酸殘基突變為精氨酸（Arg）后，RABV可致死成年小鼠，即弱毒致病性發生改變（Tao et al.，2010;Zhang et al.，2013）。Yamada等（2014）研究發現，多數RABV流行株的G蛋白存在第37位和第319位2個糖基化位點，當G蛋白發生糖基化時也會影響病毒毒力。家犬在傳播RABV的過程中起重要作用，廣西農村散養家犬數量龐大，接種疫苗率低是狂犬病高發的主要原因。1999—2001年廣西的臨床健康犬RABV陽性率為1.10%（羅廷榮等，2007），2002—2005年的RABV陽性率為3.25%～4.39%，2006—2011年的RABV陽性率為3.72%～1.26%，2011—2012年的RABV陽性率為0.20%，2013—2018年的RABV陽性率為0。隨著家犬免疫接種率的提高，廣西狂犬病致死亡人數呈逐年下降趨勢，由2004年的602人降至2016年的57人，說明人類的狂犬病發病率與家犬帶毒率呈正相關（羅廷榮等，2017）。免疫接種是降低臨床健康犬帶毒的重要手段，但免疫抗體同時給RABV生存帶來壓力，誘發其產生變異，因此監測病毒遺傳穩定性及分析其變異規律，對有效防控狂犬病具有重要意義。【本研究切入點】已有相關研究對不同時期廣西RABV的遺傳特性進行分析，并證實RABV廣西流行株絕大部分屬于Group I和Group II型毒株，Group III型毒株較少（Tang et al.，2013;Wei et al.，2018），但鮮見針對廣西近20年來的RABV流行株進行綜合評估分析。【擬解決的關鍵問題】對本課題組2018年從患狂犬病家犬腦組織分離獲得的2株RABV野毒株進行全基因組測序，并與近20年來的RABV廣西流行株進行遺傳變異分析，旨在揭示廣西RABV的流行變異規律及進化特征，為廣西狂犬病防控提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

2018年從患狂犬病家犬腦組織分離獲得2株RABV野毒株（GXSL2018和GXYZ2018），其中，GXSL2018株分離自廣西南寧市上林縣咬人的患狂犬病家犬腦組織，GXYZ2018株分離自廣西河池市宜州區咬牛的患狂犬病家犬腦組織。組織RNA提取試劑盒、pMD18-T載體、PrimeSTAR Max和M-MLV Reverse Transcriptase購自TaKaRa公司;DNA膠回收試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、dNTPs和DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司;胰蛋白胨和酵母提取物購自Oxid公司;LA固體培養基、LB液體培養基和大腸桿菌TOP10感受態細胞由亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室自配或保存提供。

1. 2 引物設計與合成

參照RABV廣西毒株GX074全基因組序列（GenBank登錄號MG201923.1），采用Primer 5.0進行RABV全基因組合成引物（表1）設計，并委托深圳華大基因股份有限公司合成。

1. 3 RT-PCR擴增

參照組織RNA提取試劑盒說明提取GXSL2018和GXYZ2018株的總RNA，并反轉錄合成cDNA。RT反應體系25.0 μL：5×Buffer 5.0 μL，dNTPs 2.0 μL，RNasin 0.5 μL，M-MLV Reverse Transcriptase 0.5 μL，上游引物1.0 μL，RNA模板16.0 μL。反轉錄程序：42 ℃ 1 h，90 ℃ 5 min。以反轉錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系26.0 μL：PrimeSTAR Max 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板3.0 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序：98 ℃預變性3 min;98 ℃ 10 s，退火溫度（表1）退火15 s，延伸溫度72 ℃（延伸速率1 kb/min），據此計算延伸時間，進行35個循環;72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對目的條帶進行DNA膠回收純化。

1. 4 全基因組序列比對分析

將目的片段與pMD18-T載體在4 ℃下連接過夜，然后轉化感受態細胞。挑取疑似陽性單克隆菌落進行擴大培養，經菌液PCR鑒定呈陽性的菌液送至深圳華大基因股份有限公司測序。測序結果采用SeqMan完成序列拼接，并與近20年來的RABV廣西流行株（表2）全基因組序列進行比對分析。

2 結果與分析

2. 1 RABV全基因組序列比對分析結果

利用12對引物分別對GXSL2018和GXYZ2018株進行全基因組分段擴增，獲得相應目的片段后采用SeqMan進行序列拼接，結果得到2株RABV野毒株的全基因組序列，其基因組全長均為11923 bp，GenBank登錄號分別為MN186249和MN186250。

從NCBI下載2000—2019年RABV廣西流行株的全基因組序列，運用MegAlign進行同源性比對分析，結果發現不同RABV廣西流行株間的核苷酸序列同源性在87.1%～99.1%，其中GXSL2018株和GXYZ2018株的同源性為99.4%（圖1）。9株RABV廣西流行株的基因組序列全長為11921～11924 bp（表3），其主要區別在于P-M間隔區和5'-UTR，P-M間隔區多為87 bp（6株），只有3株毒株為86 bp，5'-UTR多為130或131 bp，但LB19株的5'-UTR為129 bp。2018年分離獲得的GXSL2018株和GXYZ2018株全基因組序列均為11923 bp，與其他RABV廣西流行株相比，其主要差異是這2株毒株的3'-UTR為69 bp，且在第20位缺失一個核苷酸（圖2）。綜上所述，近20年來廣西的RABV流行株非常保守，其遺傳特性穩定。

2. 2 RABV的N基因序列比對分析結果

從NCBI下載近20年來的RABV廣西流行株及國內其他省份具有代表性毒株的N基因序列，進行遺傳進化樹分析。結果表明，2018年分離獲得的GXSL2018株和GXYZ2018株同屬于Group II型毒株（圖3）。此外，在Group II內，所有RABV廣西流行株聚類在同一個分支（紅色實線圈出的毒株）;在GroupⅠ內，所有RABV廣西流行株也聚類在同一分支上。GXYZ2018株和GXSL2018株雖然分離自廣西的不同地區，兩地相距500 km，但2株毒株的N基因核苷酸序列同源性高達99.6%。與其他省份的RABV流行株相比，RABV廣西流行株N蛋白上的RNA結合域（第298～352位氨基酸殘基）、B細胞表面抗原表位（第358～367位氨基酸殘基）和抗原位點（第359～366位氨基酸殘基和第375～383位氨基酸殘基）及Th細胞表位（第404～418位氨基酸殘基）均高度保守，因此在遺傳進化樹上RABV廣西流行毒株緊密聚在一起。

2. 3 RABV的G基因序列比對分析結果

基于G基因序列的遺傳進化分析結果也表明，GXSL2018株和GXYZ2018株同屬于Group II型毒株（圖4）。從遺傳進化樹可直觀看出，近年來RABV廣西流行株主要為Group I型和Group II型毒株，且同一組別內的RABV廣西流行株均聚類在同一分支上。成熟的G蛋白從結構上可分為3個部分：膜外區（第1～439位氨基酸殘基），該區攜帶有RABV的主要抗原決定簇位點，具有強大的免疫原性和抗原性，在受體識別和膜融合過程中發揮重要作用;跨膜區（第440～461位氨基酸殘基），該區參與G蛋白在病毒脂質雙分子層膜上的固定;膜內區（第462～505位氨基酸殘基），該區位于病毒膜內，與M蛋白和N蛋白相互作用有關（汪孟航等，2016）。通過氨基酸序列比對分析發現，RABV廣西流行株在以上重要抗原位點均高度保守，發生突變的氨基酸位點是否與病毒毒力及抗原性相關，目前尚未得到驗證。

3 討論

病毒變異是病毒病防控的主要難題。本課題組2018年從患狂犬病家犬腦組織中分離獲得2株RABV野毒株（GXSL2018和GXYZ2018），在全基因組測序的基礎上，與近20年來的RABV廣西流行株進行系統地遺傳變異分析，結果發現GXSL2018株和GXYZ2018株的基因組全長均為11923 bp，且2株毒株的開放閱讀框（ORF）長度與之前分離獲得的RABV野毒株及固定毒株一致，僅少數堿基缺失或插入出現在間隔區。何曉霞（2013）研究發現，RABV的3'-UTR較保守，通常為70 bp;但本研究發現GXSL2018株和GXYZ2018株的3'-UTR在第20位點缺失一個核苷酸。病毒的3'-UTR和5'-UTR通常被認為與病毒的轉錄和復制有關，水皰性口炎病毒（VSV）3'-UTR前24個核苷酸缺失會極大降低其轉錄復制水平（Li and Pattnaik，1999），故推測GXSL2018株和GXYZ2018株的3'-UTR缺失一個核苷酸也會影響其轉錄復制水平。

開展RABV不同功能基因的遺傳進化分析有利于判斷其流行趨勢。N基因高度保守和高效表達的特性，被視為RABV基因分型的重要判斷指標（路靜等，2015）。RABV廣西流行株主要屬于Group I和Group II型毒株（熊毅等，2008），本課題組2018年分離獲得的GXYZ2018株和GXSL2018株同屬于Group II型毒株，其N蛋白上的B細胞表面抗原表位（第358～367位氨基酸殘基）、Th細胞表位（第404～418位氨基酸殘基）和RNA結合域（第298～352位氨基酸殘基）均高度保守，與Kouznetzoff等（1998）、Faber等（2002）分離報道的毒株高度一致，而其他發生變異的少數氨基酸殘基，與N蛋白功能位點無關。G蛋白負責誘導機體產生中和抗體，也是決定RABV致病性的重要蛋白，位于病毒膜表面，與細胞受體結合（Faber et al.，2002）。本研究對近20年來的RABV廣西流行株進行比對分析，結果發現G蛋白上與病毒毒力密切關聯的第333、336、339和357位氨基酸殘基及中和抗體相關表位和受體結合位點的氨基酸殘基均未發生變異，高度保守。此外，P蛋白和M蛋白功能位點的氨基酸殘基也非常保守，均未發生變異。綜上所述，GXYZ2018株和GXSL2018株與近20年來的RABV廣西流行株高度相似，病毒蛋白主要功能區的氨基酸序列高度保守，尚未發生變異，全基因組遺傳特性穩定。

4 結論

GXYZ2018株和GXSL2018株同屬于Group II型毒株，與近20年來的RABV廣西流行株高度相似，病毒蛋白主要功能區的氨基酸序列高度保守，尚未發生變異，全基因組遺傳特性穩定。

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（責任編輯 蘭宗寶）