利用PCR法檢測熟牛肉的肉源性

□ 賈南南 李建平 范美霞 菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院

1 引言

隨著社會的發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，對肉制品的要求也越來越高。但是，肉制品市場存在肉類摻假、以次充好等欺騙消費者的行為，不法商販為了追求自身利益以“掛羊頭賣狗肉”的方式用劣質肉冒充高質量的肉制品。利用常規(guī)的檢測方法只能從感官及形態(tài)上鑒別肉類，無法從溯源層面解決肉類摻假的問題，例如對于腌制加工的熟牛肉，消費者就很難通過肉眼辨別其是否為牛肉。

隨著分子生物學的發(fā)展，以DNA為基礎的PCR技術被廣泛應用于動物源性成分的檢測[1-4]，即聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）溯源是以DNA遺傳物質為基礎鑒別肉及肉制品。聚合酶鏈式反應是一種在體外特異性擴增DNA序列的技術，其基本過程為3個階段的多次循環(huán)—模板雙鏈DNA的變性、引物與模板DNA的退火、在DNA聚合酶引導下的鏈延伸反應，且每一次循環(huán)后的擴增產物均可作為下一輪循環(huán)的模板。就理論而言，擴增產物量呈指數形式上升，即經過n個循環(huán)后，產物量增加到2n倍。此方法在動物源性成分檢測、肉類摻假鑒別等應用上已有多個報道[7，8]。本研究針對菏澤市市場上銷售的肉及肉制品進行抽樣檢測，利用實時熒光PCR方法鑒別牛、豬、馬源性成分，以期發(fā)現是否存在摻假的情況，旨在為肉制品摻假檢測提供一定的參考依據。

2 材料和方法

2.1 材料

12份市售熟牛肉。

2.2 儀器

絞肉機，小熊電器股份有限公司；金屬浴，杭州奧盛儀器有限公司；Rotor Gene Q 熒光定量PCR儀，德國凱杰。

表1 實時熒光PCR 檢測結果

2.3 試劑

無水乙醇，天津市富宇精細化工有限公司；DNA提取試劑盒，天根生物公司；豬源性檢測試劑盒、牛源性檢測試劑盒，Takara公司；馬引物及探針（SN/T3730.5-2013）、PCR體系預混液2xTaqMan Fast qPCR Master Mix（Probe qPCR），上海生工合成。

2.4 樣品處理

取適量樣品放入燒杯中，用溫水沖洗并擠干水分，往復數次，用干凈的絞肉機粉碎，備用。

2.5 樣品總DNA提取

按照DNA提取試劑盒說明書進行操作。

2.6 DNA純度與濃度

打開核酸蛋白檢測儀，吸取 DNA溶解液2μL加入加樣口，分別測定260nm與280nm吸光度，測定DNA提取液的濃度和純度。

圖1 牛源性成分檢測

圖2 馬成分檢測

圖3 豬源性成分檢測

2.7 聚合酶鏈式反應（PCR）

2.7.1 牛源性實時熒光PCR反應

以提取的各個DNA樣品為模板，按牛源性檢測試劑盒說明書操作。

2.7.2 豬源性實時熒光PCR反應

以提取的各個DNA樣品為模板，按豬源性檢測試劑盒說明書操作。

2.7.3 馬成分檢測

以提取的各個DNA樣品為模板，作陽性對照、陰性對照、空白對照。

反應體系：2xTaqMan Fast qPCR Master Mix 1 0 μ L 、 1 0 μ M F o r w a r d P r i m e 0.4 μ L 、 1 0 μ M Reverse Primer 0.4μL、10μM probe 0.4μL、DNF Buffer 2μL、模板 DNA 1μL、dH2O 5.8μL。

反應條件：預變性94℃3min，變性94℃5s，退火延伸60℃30s（收集熒光信號），40個循環(huán)。

3 結果與分析

3.1 DNA模板質量

所有樣品DNA提取液OD260/OD280值為1.6～1.7，濃度為50～100ng/μL，模板DNA在純度及濃度上都能夠滿足進行PCR檢測的要求。

3.2 實時熒光PCR 檢測結果

分別配制牛、豬源性熒光PCR反應體系和馬成分熒光PCR反應體系，Ct值如表1所示。當樣品的Ct值不為0且小于35，并有典型的擴增曲線時，則判定樣品檢出該動物源性成分；反之則為未檢出該動物源性成分。

4 討論

動物源性食品大多為動物組織，其結構緊密，富含蛋白質、脂肪等大分子物質，而熟肉制品在制作過程添加了入味調料等，這些物質會在DNA提取過程中產生共沉淀，倘若提取不當將會影響后續(xù)PCR檢測。因此，在提取DNA的過程中，去除雜質，得到高DNA純度尤為重要。本方法在前處理時用溫水多次洗滌，去除入味的香料和鹽等成分，DNA提取采用試劑盒介質吸附法（硅基質），DNA純度高，雜質等抑制物少，是PCR成功的保證。檢測結果顯示，所抽取的市售12批樣本中均檢出牛源性成分，2批既檢出牛源性成分又檢出馬成分，說明樣本可能存在馬肉摻假為牛肉的問題。