柳州酸筍中降亞硝酸鹽乳酸菌的篩選及鑒定

陳正培，蔣 潮，夏嫻潤，王辰予，吳錦蘭，熊建文*

（廣西科技大學 鹿山學院，廣西 柳州 545616）

柳州酸筍屬于典型的泡菜，是將大頭甜筍和井水混合后進行厭氧發酵而制成，主要的發酵菌株來源于井水和大頭甜筍自身所攜帶的乳酸菌。如同其他泡菜一樣，在酸筍發酵過程中容易產生亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽的存在會對人體健康產生潛在危害[1]。過量的亞硝酸鹽在人體內可轉化為亞硝胺，而亞硝胺具有強烈的致癌作用[2]。人體長期攝入過量的亞硝酸鹽可引發胃癌、肺癌等疾病產生[3-6]。此外，過量的亞硝酸鹽會引起急性中毒，輕者出現頭暈嘔吐、全身乏力等癥狀；重者可引起呼吸困難、昏迷甚至窒息死亡[7]。有研究表明，許多乳酸菌如植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）等[8-9]具有降解亞硝酸鹽的能力，這些乳酸菌所產生的亞硝酸鹽還原酶在降解亞硝酸鹽上起到了重要作用[10-11]。杜曉華等[12-16]從多種酸制品中篩選出了降解亞硝酸鹽的優良乳酸菌，而且這類降解亞硝酸鹽的乳酸菌在乳酸腸球菌（Enterococcus lactococcus）、消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）以及植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）中均有存在[17-18]。

柳州酸筍是柳州螺螄粉的重要輔料，是形成柳州螺螄粉的獨特風味的重要成份。然而在發酵過程中具有產生亞硝酸鹽的潛在可能性。因此，本研究用MRS-CaCO3培養基對酸筍發酵液中的乳酸菌進行分離，通過測定亞硝酸鹽降解率，從柳州酸筍中篩選出降解亞硝酸鹽的功能性乳酸菌，并研究影響其亞硝酸鹽降解的因素，為今后開發降亞硝酸鹽的微生態活性菌劑奠定基礎，對無亞硝酸鹽的優質酸筍研發具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

酸筍發酵液樣品：采集于廣西柳州市區、柳城縣、鹿寨縣，共33份樣品。

1.1.2 化學試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、瓊脂粉、胰蛋白胨、多聚蛋白胨、細菌學蛋白胨（均為生化試劑）：廣東環凱微生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉、磷酸氫二鉀、亞硝酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

MRS固體培養基、MRS液體培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Eclipse E200生物顯微鏡：日本尼康公司；Master-S15超純水機：上海和泰儀器有限公司；L9800基因擴增儀：北京萊普特科學儀器有限公司；GenoSens1880凝膠成像分析系統：上海勤翔科學儀器有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

將采集的酸筍發酵液稀釋后，利用傾注法在含鈣乳酸細菌MRS固體培養基上進行分離，挑選具有鈣溶圈較大的菌落，于MRS固體平板上純化2次后進行甘油保存。

1.3.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的初篩

用無菌接種環取試管中保存的目標菌株1環，接種到MRS液體培養基中，于37℃培養10h，測定菌液在波長600nm處的吸光度值（OD600nm值），調整菌液的OD600nm值為0.6，將其作為種子液。然后將目標菌株按1%（V/V）的接種量接種于亞硝酸鹽質量濃度為125 mg/mL 的MRS液體培養基中，37 ℃恒溫靜置培養24 h，取0.1 mL菌液置于10 mL離心管中，依次加入0.25 mL飽和硼砂溶液、0.1 mL亞鐵氰化鉀溶液、0.1 mL乙酸鋅溶液和4 mL超純水，混勻后于8 000×g離心1 min。取2.5 mL上清液加入10 mL離心管中，加入0.50 mL對氨基苯磺酸溶液，渦旋混勻后避光靜置5 min，再加入0.25 mL鹽酸萘乙二胺溶液和1.75 mL超純水，渦旋混勻后避光靜置10 min。于波長538 nm處測定吸光度值，繪制標準曲線，按照標準曲線回歸方程計算亞硝酸鹽含量，并按下式計算亞硝酸鹽降解率。

式中：x為菌株的亞硝酸鹽降解率，%；C0為原培養基中亞硝酸鹽質量濃度，mg/mL；C1為測試樣品質量濃度，mg/mL；100為換算系數。

1.3.3 降解亞硝酸鹽乳酸菌的復篩

將目標菌株按1%的接種量（V/V）接種于亞硝酸鹽含量為625 mg/mL的MRS液體培養基中，37 ℃恒溫靜置培養12 h，測定菌液中的亞硝酸鹽含量，計算降解率，方法同上。

1.3.4 菌株的形態學觀察[13]

將目標菌株在MRS固體培養基上進行培養，觀察菌株菌落形態，再對菌株進行革蘭氏染色，觀察菌株細胞形態。

1.3.5 目標菌株的分子生物學鑒定

將目標菌株接種于MRS液體培養基中，于37℃、200r/min條件下振蕩培養過夜，收集菌體并提取菌體的總DNA（具體方法參考試劑盒說明書）。以其為模板，用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對其16 S rDNA序列進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR擴增體系：2×PCR Mix 10 μL，Primer 27F 0.5 μL，Primer 1492 R 0.5 μL，Tempted DNA 1.0 μL，ddH2O 8.0 μL。

PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；98 ℃變性30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸1min，循環30次；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物送至華大基因生物公司進行測序。

測序結果在美國國立生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行基本局部比對搜索工具（basic localalignmentsearch tool，BLAST）同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用軟件MEGA6.0中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.6 不同因素對乳酸菌降解亞硝酸鹽能力的影響

碳源的確定：分別以同樣濃度的蔗糖、乳糖和可溶性淀粉等碳源替代含625 mg/mL亞硝酸鹽的MRS液體培養基中的葡萄糖，經過121 ℃、30 min滅菌處理冷卻，將目標菌株的種子液按照1.0%（V/V）接種量接種到上述培養基中，于37 ℃恒溫靜置培養，分別在12 h、24 h、36 h、48 h、60 h取菌液進行亞硝酸鹽含量測定，考察不同碳源對亞硝酸鹽降解率的影響。

氮源的確定：分別以同樣濃度的胰蛋白胨、細菌學蛋白胨和多聚蛋白胨等氮源替代含625 mg/mL亞硝酸鹽的MRS液體培養基中的蛋白胨，經過121 ℃、30 min滅菌處理冷卻，將目標菌株的種子液按照1.0%（V/V）接種量接種到上述培養基中，于37 ℃恒溫靜置培養，不同時間取菌液測定亞硝酸鹽含量測定，考察不同氮源對亞硝酸鹽降解率的影響。

接種量的確定：將目標菌株的種子液分別按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%（V/V）的接種量接種于含625 mg/mL的亞硝酸鹽MRS液體培養基中，于37 ℃恒溫靜置培養，考察不同接種量對亞硝酸鹽降解率的影響。

pH值的確定：將目標菌株的種子液按照1.0%（V/V）接種量分別接種到pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的并含有625 mg/mL的亞硝酸鹽MRS液體培養基中，于37 ℃恒溫靜置培養，考察不同pH值對亞硝酸鹽降解率的影響。

溫度的確定：將目標菌株的種子液按1.0%（V/V）的接種量接種于含625 mg/mL的亞硝酸鹽MRS液體培養基中，分別于22 ℃、27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃、47 ℃溫度條件下進行靜置培養，考察不同溫度對亞硝酸鹽降解率的影響。

1.3.7 數據處理與統計

所有實驗數據重復3次，使用Excel2013進行標準偏差分析，用T-test進行差異性分析，用Origin9.0軟件進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 降亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

2.1.1 乳酸菌的分離

利用MRS-CaCO3培養基對33份酸筍發酵液中的乳酸菌進行分離、得到22株形態均一的白色菌落，所有菌落周圍都出現典型的溶鈣圈，將其純化后進行編號，分別為：LC-3-1、LC-3-2、LC-3-3、LC-3-4、LC-3-5、LC-3-6、LC-3-7、LC-3-8、LC-3-9、LC-3-10、LC-3-11、LC-3-12、LC-3-13、LC-3-14、LC-3-15、LC-3-16、LC-3-17、LC-3-18、LC-3-19、LC-3-20、LC-3-21、LC-3-22。

2.1.2 亞硝酸鹽乳酸菌初篩和復篩

在125 mg/mL亞硝酸鹽質量濃度下22株菌的亞硝酸鹽降解率結果見表1。

表1 22株菌的亞硝酸鹽降解率Table 1 Degradation rates of nitrite of 22 strains

由表1可知，通過初篩比較22株候選菌株的亞硝酸鹽降解率，其中，菌株LC-3-1、LC-3-2、LC-3-3和LC-3-9的亞硝酸鹽降解率超過99%。對這四株菌亞硝酸鹽降解率進行復篩，亞硝酸鹽的降解能力大小依次為菌株LC-3-3＞菌株LC-3-2＞菌株LC-3-1＞菌株LC-3-9，結果見表2。由表2可知，菌株LC-3-3亞硝酸鹽降解率最大，平均值為76.58%。因此，對菌株LC-3-3進行下一步試驗。

表2 625 mg/mL亞硝酸鹽濃度下4株菌的亞硝酸鹽降解率Table 2 Degradation rates of nitrite of 4 strains at nitrite concentration of 625 mg/ml

2.2 菌株LC-3-3的形態學觀察

菌株LC-3-3的菌落及細胞形態觀察結果見圖1。由圖1A可知，菌株LC-3-3的菌落在MRS固體培養基中呈圓形，中等大小，凸起，微白色，濕潤，邊緣整齊，菌落背面為黃色。由圖1B可知，菌株LC-3-3呈典型的革蘭氏陽性，桿狀、無芽孢，單細胞大小為（6.34×5.08）μm。

圖1 菌株LC-3-3的菌落（A）及細胞（B）形態Fig.1 Colony (A) and cell (B) morphology of strain LC-3-3

2.3 分子生物學鑒定

以菌株LC-3-3的基因組DNA為模板，以細菌鑒定通用引物27F及1492R為引物進行PCR擴增，采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，結果見圖2。由圖2可知，PCR擴增產物在1 500 bp左右，與預期結果相符，送至測序公司進行測序。

圖2 菌株LC-3-3 16S rDNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of strain LC-3-3 16S rDNA PCR amplification products

菌株LC-3-3的16S rDNA序列經同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，構建系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株LC-3-3與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）聚于一支，親緣關系最近，同源性為99%。因此，菌株LC-3-3被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖3 基于16S rDNA序列菌株LC-3-3的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain LC-3-3 based on 16S rDNA sequences

2.4 不同因素對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響

2.4.1 不同碳源對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響

以上4種碳源分別作為培養基中唯一碳源時，培養植物乳桿菌LC-3-3，每隔12 h取樣測定發酵液中亞硝酸鹽的含量，分別取樣5次，分析4種碳源對植物乳桿菌LC-3-3降解亞硝酸鹽的影響，結果見圖4。由圖4可知，各碳源對亞硝酸鹽降解率的影響為葡萄糖＞蔗糖＞乳糖＞可溶性淀粉。對它們進行兩兩比較，分析碳源間的顯著性差異，結果見表3。由表3可知，除蔗糖與乳糖培養基間無顯著性差異外（P＜0.05），其他均有顯著性差異（P＜0.05）。呈現這種結果的原因可能是碳源結構的差異，葡萄糖作為單糖，可以直接被植物乳桿菌LC-3-3利用，有利于對亞硝酸鹽的降解；而蔗糖和乳糖屬于二糖，需要被分解后才能利用，利用其降解亞硝酸鹽的效果次之，可溶性淀粉屬于多糖，被分解的效率更低，植物乳桿菌LC-3-3利用其降解亞硝酸鹽的效果更差。

圖4 不同碳源對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on nitrite-degrading ability of Lactobacillus plantarum LC-3-3

表3 4種碳源間的差異性分析Table 3 Differences analysis among the four carbon sources

2.4.2 不同氮源對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響

以上4種氮源分別作為培養基中唯一氮源來培養植物乳桿菌LC-3-3，每隔12 h取樣測定發酵液中亞硝酸鹽的含量，分別取樣5次進行測定，分析4種氮源對植物乳桿菌LC-3-3降解亞硝酸鹽的影響，結果見圖5。如圖5所示，亞硝酸鹽降解率為蛋白胨＞細菌學蛋白胨＞胰蛋白胨＞多聚蛋白胨。對它們進行兩兩比較，分析氮源間的顯著性差異，如表4所示，蛋白胨、細菌學蛋白胨和胰蛋白胨三種培養基間的降解率無顯著性差異（P＞0.05），發酵多聚蛋白胨與蛋白胨和細菌學蛋白胨有顯著性差異（P＜0.05）。因此蛋白胨、細菌學蛋白胨和胰蛋白胨均可作為植物乳桿菌LC-3-3降解亞硝酸鹽的氮源，而多聚蛋白胨不利于植物乳桿菌LC-3-3對亞硝酸鹽的降解。

圖5 不同氮源對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on nitrite-degrading ability of Lactobacillus plantarum LC-3-3

表4 4種氮源間的差異性分析Table 4 Differences analysis among the four nitrogen sources

2.4.3 不同接種量對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響

將植物乳桿菌LC-3-3分別以0.5%、1.0%、2.0%、4.0%和6.0%進行接種，每隔12 h取樣測定發酵液中亞硝酸鹽的含量，分別取樣5次進行測定，分析接種量對植物乳桿菌LC-3-3降解亞硝酸鹽的影響，結果如圖6所示，不同時期亞硝酸鹽降解率隨培養時間的增加而升高，且隨著接種量的減少而降低。對它們進行兩兩比較，分析接種量間的顯著性，結果見表5。由表5可知，相鄰接種量間均有顯著差異（P＜0.05）。因此，接種量越高，生物量越大，越有利于亞硝酸鹽的降解。

圖6 不同接種量對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽的能力的影響Fig.6 Effects of different inoculum on nitrite-degrading ability of Lactobacillus plantarum LC-3-3

表5 接種量間的差異性分析Table 5 Differences analysis among the inoculum

2.4.4 不同pH對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響

圖7 不同pH對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽的能力的影響Fig.7 Effects of different pH value on nitrite-degrading ability of Lactobacillus plantarum LC-3-3

由圖7可知，在pH4.5～pH6.0之間，隨著接pH的增加，亞硝酸鹽降解降解率逐漸增加，在pH6.0～8.0之間，隨著pH的增加，亞硝酸鹽降解率逐漸降低，且在發酵的60 h內均出現這種趨勢，因此植物乳桿菌LC-3-3降解亞硝酸鹽的最適pH為6.0，弱酸性環境促進了植物乳桿菌LC-3-3對亞硝酸鹽的降解。

2.4.5 不同溫度對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響由圖8可知，發酵溫度為22～47 ℃之間，隨著溫度的升高，植物乳桿菌LC-3-3對亞硝酸鹽的降解率呈先增強后減弱的趨勢，其降解亞硝酸鹽的最適溫度為37 ℃。比較不同溫度發酵12 h的亞硝酸鹽降解率，37 ℃條件下的降解率明顯高于其他溫度，隨著發酵時間的延長，不同溫度間降解率的差異逐漸縮小，這可能是因為37 ℃條件下植物乳桿菌LC-3-3生長最好，生物量最大，但隨著發酵時間的延長，其溫度條件下的生物量也得到了積累，縮小了不同溫度條件下生物量的差異，從而縮小了亞硝酸鹽降解率的差異。

圖8 不同溫度對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽的能力的影響Fig.8 Effects of different temperature on nitrite-degrading ability of Lactobacillus plantarum LC-3-3

3 結論

本研究從柳州自然發酵酸筍中分離純化獲得一株降亞硝酸鹽能力較好的菌株LC-3-3，經形態學觀察、分子生物學鑒定其為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。該菌株在MRS培養基中生長良好，采用MRS培養基的其他組分及其濃度，以葡萄糖為唯一碳源（添加量為20 g/L）、蛋白胨為唯一氮源（添加量為10 g/L）、接種量為6%、pH值為6.0、溫度為37 ℃的條件下，最適合植物乳桿菌LC-3-3對亞硝酸鹽的降解。該菌株源于廣西發酵酸筍，將其用于酸筍發酵具有安全性高的顯著特點，此外，由于竹筍的季節性，發酵酸筍的保藏期通常需要長達1年時間，該菌株的獲得在輔助酸筍發酵，降低酸筍中亞硝酸的含量具有良好的應用價值。