拮抗黃曲霉枯草芽孢桿菌21-1-2發酵條件的優化

金黎明，王曉彤，宮小明，權春善，趙 晶，侯熙彥

（1.大連民族大學 生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116605；2.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東 濰坊 261041）

黃曲霉（Aspergillus flauvs）是一種世界范圍常見的許多重要農作物以及動物的共同致病菌，由于其產生的次級代謝產物—黃曲霉毒素具有極強的致癌、致突變和致畸作用，尤其是黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）毒性最強、危害最大，被世界衛生組織列為毒物之首，定為IA類致癌物質[1-2]，因此，黃曲霉的防治仍然是亟需解決的問題。目前，糧食和食品中黃曲霉防治的方法主要有物理方法（如吸附[3]、萃取[4]、熱處理[5]、射線處理[6]等）、化學方法[7]、加強采后貯藏管理和生物防治等，其中，生物防治技術被認為是最有前途和最有效的方法[8-9]。

近年來發現的能有效防治黃曲霉的微生物主要有芽孢桿菌（Bacillus）、乳桿菌（Lactobacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）、扁座殼孢（Aschersonia placenta）等。徐進等[10]研究發現，乳桿菌培養液對黃曲霉孢子萌發具有顯著的抑制作用；曹冬梅等[11]將彎曲乳酸桿菌（Lactobacillus curvatus）與黃曲霉（Aspergillus flavus）共培養，結果發現黃曲霉菌絲產量明顯降低；郭艷萍等[12]以泡菜、新鮮豬腸、豆漿渣、雞腸道內容物為材料，采用牛津杯法篩選出6株對黃曲霉的生長有明顯的抑制作用的拮抗菌株，其中，3株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），2株為消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius），1株為亞利桑那乳桿菌（Lactobacillus arizonenensis）；GOURAMA H等[13]研究表明，市售的青貯飼料接種植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的混合菌種，對黃曲霉具有抗菌活性；DEY R等[14]研究發現，從花生根際篩選的假單胞菌對黃曲霉具有防治效果；潘潔茹等[15]從福建省建甌市柑桔園分離篩選出一株蟲生真菌，扁座殼孢Jos009，用濾紙片法研究了其胞外代謝產物對黃曲霉菌生長的抑制作用，結果表明抑制作用明顯，抑菌圈直徑達17 mm。其中，關于芽孢桿菌的報道最多。徐銘乾等[16]篩選出一株能夠抑制黃曲霉生長的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）HSP-5；李俊峰等[17]以煙臺黃曲霉污染區域土壤為材料，采用稀釋分離法和瓊脂擴散法，篩選到1株對黃曲霉有抑制作用的空氣芽孢桿菌（Bacillus aerius）Y-17-3；涂彩虹等[18]從土壤中分離純化出一株具有黃曲霉拮抗活性的枯草芽孢桿菌，該菌株的次生代謝產物具有抑制黃曲霉生長的效果，抑菌率可達63%；PETCHKONGKAEW A等[19]將從泰國北部的大豆和新鮮豆豉分離出來的23株芽孢桿菌與黃曲霉共培養，發現大多數芽孢桿菌都可抑制黃曲霉生長，效果最好的兩種菌株分別為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。XIA X H等[20]分離到一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）JSW-1，對黃曲霉的抑制率為58.3%。AFSHARMANESH H等[21]研究發現，枯草芽孢桿菌UTB1可抑制黃曲霉孢子的萌發，抑制率為39.45%；但是，目前仍然存在抑制效果差的的問題。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis）是一類常見的安全性較高的革蘭氏陽性菌，具有多種抑菌作用。本研究以從花生原產地土壤中篩選得到的1株對黃曲霉具有較強拮抗作用的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）21-1-2為研究對象，抑菌圈直徑為響應值，通過單因素試驗和響應面試驗對其發酵條件進行優化，為進一步研究該菌株的抗菌活性物質及其相關次級代謝產物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黃曲霉（Aspergillus flavus）（保藏號CGMCC3.2890）：中國普通微生物菌種保藏管理中心；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）21-1-2：濰坊出入境檢驗檢疫局。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨、瓊脂、酵母提取物（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術責任有限公司；氯化鈉、無水乙醇（均為分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：土豆去皮切塊，每200 g加入500 mL去離子水，煮沸30 min。雙層紗布過濾后，加入20 g蔗糖，20 g瓊脂粉，加去離子水至1 L；115 ℃條件下高壓滅菌30 min。

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20g，去離子水1L，pH7.0；121℃條件下高壓滅菌20min。LB液體培養基中不添加瓊脂。

1.2 儀器與設備

S-4800型掃描電子顯微鏡：日本Hitachi公司；JA12002型電子天平：精密科學儀器公司；MLS-3020型濕熱高壓滅菌器：日本SANYO公司；BUCHI Rota vapor R-200型旋轉蒸發儀：上海精宏試驗設備有限公司；SW-OJ-2FD型潔凈工作臺：蘇州安泰安氣技術有限公司；MT-180B型生化恒溫培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；HWY111型恒溫培養振蕩器：智誠分析儀器制造公司。

1.3 方法

1.3.1 黃曲霉孢子的制備

將黃曲霉菌株接種到PDA斜面，28 ℃條件下培養6 d后加入4 mL 0.9%的無菌生理鹽水，充分振蕩后濾掉菌絲，調整孢子濃度為1×107個/mL，待用。

1.3.2 拮抗黃曲霉活性的測定

采用濾紙片法[25]測定抑菌活性。具體操作：取100 μL制備好的黃曲霉孢子液均勻涂布于PDA平板。將Bacillus subtilis21-1-2發酵液離心（13 000 r/min，10 min），去除菌體，收集上清液過0.22μm無菌微孔濾膜，取上清液100μL緩慢滴于涂布有黃曲霉的培養皿中的8mm濾紙片上，28℃恒溫培養48 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，平行試驗3次，取平均值。

1.3.3 枯草芽孢桿菌21-1-2培養條件優化

初始發酵條件：將Bacillus subtilis21-1-2按1%（V/V）的接種量接種于LB液體培養基，初始發酵條件為培養溫度37 ℃、初始pH 7.0、搖床轉速180 r/min、培養時間36 h。

單因素試驗：采用單因素輪換法，依次考察培養時間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h）、培養溫度（31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃）、初始pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、轉速（140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min）對Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響。

響應面試驗：在單因素試驗基礎上，以抑菌圈直徑（Y）為響應值，選取培養時間（A）、培養溫度（B）、初始pH值（C）及轉速（D）為考察因素，根據Box-Behnken試驗設計原理，設計4因素3水平的Box-Behnken試驗[22]，以-1、0、1分別代表自變量的低、中、高水平。各因素與水平見表1。

表1 枯草芽孢桿菌21-1-2培養條件優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for culture conditions optimization of Bacillus subtilis 21-1-2

采用Design-Expert.V 8.0.6軟件對數據進行二次回歸擬合，得到多元二次回歸方程，分析各因素的主效應和交互效應，依據回歸方程繪制響應面立體分析圖，得出響應面規范分析結果，確定最佳培養條件。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌21-1-2培養條件優化單因素試驗結果

2.1.1 培養時間對Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響

培養時間對Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響見圖1。由圖1可知，隨著培養時間的延長，抑菌圈直徑呈先增大后減小的趨勢，當培養時間為72 h時，抑菌圈直徑最大，為23.68 mm。因此，確定Bacillus subtilis21-1-2的最適培養時間為72 h。

圖1 培養時間對枯草芽孢桿菌21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響Fig.1 Effect of culture time on the activity of Bacillus subtilis 21-1-2 against Aspergillus flavus

2.1.2 培養溫度對Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響

培養溫度對Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響見圖2。由圖2可知，隨著培養溫度的升高，抑菌圈直徑呈先增大后減小的趨勢，當培養溫度為37 ℃時，抑菌圈直徑最大，為23.87 mm。因此，確定Bacillus subtilis21-1-2的最適培養溫度為37 ℃。

圖2 培養溫度對枯草芽孢桿菌21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響Fig.2 Effect of culture temperature on the activity of Bacillus subtilis 21-1-2 against Aspergillus flavus

2.1.3 初始pH值對Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響

圖3 初始pH值對枯草芽孢桿菌21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響Fig.3 Effect of initial pH on the activity of Bacillus subtilis 21-1-2 against Aspergillus flavus

初始pH值對Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響見圖3。由圖3可知，隨著初始pH值的增加，抑菌圈直徑呈先增大后減小的趨勢，當初始pH值為7.0時，抑菌圈直徑最大，為24.10 mm。因此，確定Bacillus subtilis21-1-2的最適初始pH值為7.0。

2.1.4 轉速對Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響

轉速對Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響見圖4。由圖4可知，隨著轉速的增加，抑菌圈直徑呈先增大后減小的趨勢，當轉速為180 r/min時，抑菌圈直徑最大，為24.33 mm。因此，確定Bacillus subtilis21-1-2的最適轉速為180 r/min。

圖4 轉速對枯草芽孢桿菌21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響Fig.4 Effect of shaking speed on the activity of Bacillus subtilis 21-1-2 against Aspergillus flavus

2.2 枯草芽孢桿菌21-1-2培養條件優化響應面試驗結果

響應面法常被應用在多個影響因素共同存在的優化研究工作中，此方法與傳統方法相比，具有節約時間、空間以及原材料的優點[23]。在單因素試驗的基礎上，以抑菌圈直徑（Y）為響應值，培養時間（A）、培養溫度（B）、初始pH值（C）及轉速（D）為考察因素，采用響應面分析法進行4因素3水平試驗，結果與分析見表2，回歸模型的方差分析見表3。

采用Design-expert.V 8.0.6軟件對表2的試驗結果進行多元回歸擬合，得到抑菌圈直徑（Y）對自變量培養時間（A）、培養溫度（B）、初始pH值（C）及轉速（D）的二次回歸方程：

由表3可知，模型的P值＜0.01，極顯著，說明模型構建成功，能反映響應值的變化。失擬項P值＞0.05，回歸方程擬合效果較好，模型選擇恰當。決定系數R2=0.924 5，調整決定系數R2adj=0.621 4，說明該模型的預測值與實際值具有較好的擬合性，可以用此模型對抑菌圈直徑進行預測。各因素對抑菌圈直徑影響的主次順序為A＞B＞D＞C，其中，交互項BC、CD、二次項A2、B2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項A、交互項AD、BD、二次項C2對結果影響顯著（P＜0.05），而其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。

表2 枯草芽孢桿菌21-1-2培養條件優化Box-Behnken試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken tests for culture condition optimization of Bacillus subtilis 21-1-2

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design-expert.V 8.0.6軟件依據回歸方程繪制響應面及等高線，結果見圖5。

由圖5可知，隨著各因素水平的增大，響應值呈先升高后降低的趨勢，說明存在最大值。培養溫度和初始pH值、初始pH值和轉速的等高線均為明顯的橢圓，說明培養溫度和初始pH值、初始pH值和轉速的交互作用對抑菌直徑影響極顯著。

圖5 各因素交互作用對枯草芽孢桿菌21-1-2抗黃曲霉活性影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the activity of Bacillus subtilis 21-1-2 against Aspergillus flavus

通過Design-Expert.V 8.0.6軟件對模型進行優化求解，得到Bacillussubtilis21-1-2的最佳培養條件為培養時間72.16 h、培養溫度為36.31 ℃、初始pH值6.65、轉速187.89 r/min，預測的抑菌直徑為27.76 mm。考慮到實際操作性，將最佳培養條件修訂為培養時間72 h，培養溫度36 ℃，初始pH值6.7，搖床轉速188 r/min。為了檢驗Box-Behnken試驗結果的可靠性，在最佳培養條件下進行3組平行驗證試驗。結果表明，Bacillus subtilis21-1-2對黃曲霉抑菌直徑達到27.42 mm，與預測理論值相對誤差較小，說明回歸模型預測值具有良好符合性，結果可信。

3 結論

通過單因素試驗和響應面試驗確定枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）21-1-2拮抗黃曲霉的最佳培養條件為培養時間為72 h，培養溫度36 ℃，初始pH值6.7，搖床轉速188 r/min。在此優化條件下，Bacillus subtilis21-1-2抑菌圈直徑為27.42 mm，是優化前（14.36 mm）的1.9倍。