枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶固態發酵工藝優化

羅 璇，石 玉，袁敏文，陳 同，馮光志

（1.武漢設計工程學院 食品與生物科技學院，湖北 武漢 430205；2.黃石市食品藥品檢驗檢測中心，湖北 黃石 435000）

克氏原螯蝦俗稱小龍蝦，是一種雜食性動物。自然環境中的一些水生植物、小型水生動物，甚至是同類都會成為小龍蝦的食物[1]。克氏原螯蝦腸道內存在著某些益生菌，可以分泌半纖維素酶來降解植物性食物中的半纖維素成分[2-3]，半纖維素中含有50%的木聚糖[4]。王振宇等[5-6]研究發現，牲畜飼料中木聚糖酶的添加有助于提高飼料的利用率。因此，從克氏原螯蝦腸道內篩選高產木聚糖酶活力的菌株，并通過固態發酵優化菌株的產酶工藝條件，提高木聚糖酶產生菌的產酶活力，將會有益于小龍蝦對飼料的充分利用。

目前，少量研究主要是對小龍蝦致病菌的鑒定及致病機理的研究[7]。馮光志等[8-9]在2019年初對小龍蝦腸道產木聚糖酶細菌的分離與鑒定進行了報道，而國內外對小龍蝦腸道益生菌的相關研究鮮有報道。因此，本研究以前期從克氏原螯蝦腸道內篩選的一株產木聚糖酶的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Z-3[8]為研究對象，木聚糖酶活力為響應值，利用響應面分析法對其固態發酵產酶條件進行優化，以期將其作為益生菌添加到克氏原螯蝦飼料中，為克氏原螯蝦的高產養殖提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Z-3：分離自小龍蝦腸道，保存于武漢設計工程學院生物工程實驗室[8-9]。

1.1.2 試劑

玉米芯、麩皮：武漢江夏農貿市場；酵母浸粉、蛋白胨、苯酚、無水三氯化鐵、氯化銨、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dini trosalicylic，DNS）（生化試劑或分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉、酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；木聚糖（分析純）：上海金穗生物科技有限公司；D（+）木糖（生化試劑）：上海山浦化工有限公司。

1.1.3 培養基

斜面保藏培養基（LB固體培養基）：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂2 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃條件下滅菌20 min。

液體種子培養基：LB固體培養基中不添加瓊脂。

固體發酵基礎培養基[10-11]：麩皮15 g，NH4Cl 2 g，FeCl30.34 g，蒸餾水1 000 mL，攪拌均勻，pH自然，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

722型分光光度計：天津瑞普斯儀器有限公司；TS-211B型恒溫搖床：上海天呈實驗儀器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培養箱、BXM-30R型臺式高速離心機：上海博遠實業有限公司醫療設備廠；AL104型分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 木聚糖酶粗酶液的制備

稱取1 g固態發酵基質，將其溶解在裝有10倍體積蒸餾水的50 mL離心管中，在20 ℃條件下漩渦振蕩溶解，用兩層紗布過濾發酵基質，濾液于4 000 r/min條件下離心10 min，上清液即為木聚糖酶粗酶液[12]。

1.3.2 木糖標準曲線的制作[13]

取6支試管，依次加入0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL的木糖標準溶液，補加蒸餾水至0.5 mL，各管再加入1 mL質量濃度為1 mg/mL的木聚糖溶液，搖勻，37 ℃反應8 min后，各管加入3 mL DNS試劑，搖勻，沸水浴5 min，取出加入5 mL蒸餾水，冷卻后，搖勻，于波長540 nm處測定吸光度值。以木糖質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制木糖標準曲線（y=1.951 0x-0.030 1，R2=0.994 1）。

1.3.3 木聚糖酶酶活測定[14-15]

在一支試管中加入0.5 mL粗酶液，再取一支試管加入0.5 mL蒸餾水用作調零，分別加入1.0 mL木聚糖溶液，37 ℃保溫5 min，加入3 mL DNS試劑沸水浴5 min后取出，迅速冷卻至室溫，補加蒸餾水5 mL，于540 nm處測定其吸光度值。

酶活力定義：在37 ℃條件下，1 mL酶液每分鐘水解底物生成1 μg葡萄糖的酶量為一個酶活單位，以U/mL表示。本研究中的酶活力單位選定為單位濕基培養基的酶活力，以U/g濕基表示。具體計算公式如下：

式中：E為樣品的酶活力，U/mL；S為樣品中葡萄糖質量，mg；N為粗酶液的稀釋倍數；T為反應時間，min；V為參與反應的粗酶液體積，mL。

1.3.4 枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶固態發酵工藝優化單因素試驗

取斜面保藏的枯草芽孢桿菌Z-3，按2.5%～3.0%（V/V）的接種量接入裝有100 mL LB培養基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min條件下過夜培養。按2%（V/V）的接種量將種子液接種于固態發酵培養基中，裝料量為30 g/250 mL，37 ℃條件下培養7 d，每天取一次樣，測定木聚糖酶活力，考察培養時間對Bacillus subtilisZ-3產木聚糖酶的影響。在此基礎上，以麩皮與玉米芯混合物為碳源培養3 d，考察麩皮占比（20%、40%、60%、80%、100%）對Bacillus subtilisZ-3產木聚糖酶的影響[16-17]。隨后，固定其他條件不變的情況下，依次考察添加量均為2.0 g/L氮源種類（氯化銨、硫酸銨、酵母提取物、蛋白胨）、培養基初始pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、培養溫度（27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃）、裝料量（20 g/250 mL、30 g/250 mL、40 g/250 mL、50 g/250 mL）、接種量（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）對Bacillus subtilisZ-3產木聚糖酶的影響。

1.3.5 枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶固態發酵工藝優化響應面試驗[18]

在單因素試驗的基礎上，選取影響顯著的3個因素初始pH值（A）、麩皮占比（B）及培養時間（C）為考察因素，木聚糖酶活力（Y）為響應值，采用軟件Design Expert8.0.6.1設計3因素3水平Box-Behnken試驗，因素與水平見表1。

表1 枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶固態發酵工藝優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for solid-state fermentation technology optimization of xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 培養時間對菌株Z-3產木聚糖酶的影響

培養時間對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響見圖1。

圖1 培養時間對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響Fig.1 Effect of culture time on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，酶活力逐漸升高，并于發酵3 d時達到最高（2 330 U/g），隨后呈下降趨勢，分析原因可能是枯草芽孢桿菌Z-3的生長和木聚糖酶的產生屬于同步偶聯合成，隨著發酵的進行，菌株的生長受到營養條件的限制和代謝產物的阻遏，導致發酵3 d后酶活力逐漸下降。因此，確定最佳培養時間為3 d。

2.1.2 碳源中麩皮占比對菌株產木聚糖酶的影響

根據前期試驗結果，選用價格廉價、產酶能力強的麩皮與玉米芯混合物為碳源，固態發酵枯草芽孢桿菌Z-3，又根據麩皮在固態發酵過程中具有較好的松散透氣特性，考察麩皮占比對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響，結果見圖2。

圖2 麩皮占比對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響Fig.2 Effect of bran ratio on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

由圖2可知，隨著麩皮占比的增加，木聚糖酶活力呈先增加后下降的趨勢，當碳源中麩皮占比為60%時，酶活力最高，為2 882 U/g。因此，確定最佳麩皮占比為60%。

2.1.3 氮源種類對菌株產木聚糖酶的影響

氮源種類對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響見圖3。

圖3 氮源種類對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source types on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

由圖3可知，不同氮源對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響不同。當以氯化銨為氮源時，木聚糖酶活力最高，為2 330 U/g；當以蛋白胨為氮源時，木聚糖酶活力最低，為1 170 U/g。結合工業經濟考慮，氯化銨適合作為廉價易得的大規模氮源添加劑，因此，確定最優氮源為氯化銨。

2.1.4 初始pH值對菌株產木聚糖酶的影響

初始pH值對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響見圖4。

圖4 初始pH值對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響Fig.4 Effect of initial pH on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

由圖4可知，隨著初始pH值的升高，木聚糖酶活力呈現先升高后降低的趨勢。當初始pH值為6.0時，木聚糖酶活力達到最高，為2 588 U/g。因此，確定最優初始pH值為6.0。

2.1.5 培養溫度對菌株產木聚糖酶的影響

培養溫度對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響見圖5。

圖5 培養溫度對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響Fig.5 Effect of culture temperature on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

由圖5可知，隨著培養溫度的升高，木聚糖酶活力呈現先升高后降低的趨勢。當培養溫度為37 ℃時，酶活力最高，為2 599 U/g。分析原因可能是枯草芽孢桿菌Z-3的最適宜發酵溫度也為37 ℃，利于菌株產酶，這樣也進一步驗證了枯草芽孢桿菌Z-3的生長和木聚糖酶的產生屬于同步偶聯合成。因此，選擇37 ℃作為最佳發酵溫度。

2.1.6 裝料量對菌株產木聚糖酶的影響

裝料量對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響見圖6。

由圖6可知，隨著裝料量的增加，木聚糖酶活力呈先升高后下降的趨勢，但裝料量對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響不顯著。當裝料量為30 g/250 mL時，木聚糖酶活力最高，為2 658 U/g。分析原因可能與枯草芽孢桿菌Z-3的來源有關，其來源于小龍蝦腸道，腸道微生物多為厭氧或兼性好氧微生物，它們的生長與氧的關系不是特別密切，而裝料量正是側面反映微生物對氧的需求程度。因此，確定最優裝料量為30 g/250 mL。

圖6 裝料量對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響Fig.6 Effect of loading volume on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

2.1.7 接種量對菌株產木聚糖酶的影響

接種量對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響見圖7。

圖7 接種量對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響Fig.7 Effect of inoculum on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

由圖7可知，木聚糖酶活力隨接種量的增高呈先升高后下降的趨勢，但接種量對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的影響不顯著。當接種量為2.5%時，木聚糖酶活力最高，為2 598 U/g。分析原因可能是接種量過大會引起溶氧不足，影響產物合成，而且會過多移入代謝廢物，也不經濟；過小會延長培養時間，降低發酵罐的生產率。因此，確定最佳接種量為2.5%。

2.2 枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶工藝優化響應面試驗

根據單因素試驗結果，確定最優氮源為氯化銨，培養溫度為37 ℃，裝料量為30 g/250 mL，接種量為2.5%，選取影響顯著的因素初始pH值（A）、麩皮占比（B）及培養時間（C）為考察因素，木聚糖酶活力（Y）為響應值，采用軟件Design Expert 8.0.6.1設計3因素3水平Box-Behnken試驗，結果與分析見表2，回歸模型的方差分析結果見表3。

表2 Box-Behnken試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken tests

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用軟件Design Expert 8.0.6.1對表2的結果進行多元二次回歸擬合，得到以木聚糖酶活力（Y）為因變量，初始pH值（A）、麩皮占比（B）及培養時間（C）為自變量的二次多項回歸方程：Y=389.60-18.73A+42.65B+43.88C-154.9A2-238.65B2-202.60C2。

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型的擬合程度較良好。方程的決定系數R2=0.995 6，調整決定系數R2adj=0.990 0，說明該模型設計良好，試驗誤差小，在實驗范圍內能較準確的預測木聚糖酶的活力。方程的一次項A、B、C對結果影響顯著（P＜0.05），二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。各因素間交互作用對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶影響的響應面及等高線見圖8。

圖8 各因素交互作用對枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶影響的響應面及等高線Fig.8 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

響應面圖形分析可以直觀地反映出各因素之間的交互作用對于響應值的影響[19]；等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。相應曲面的最高區域存在最大值[20]，即試驗結果Y在試驗區域內具有最大極值。由圖8可知，三個交互影響的等高線圖類似圓形，說明初始pH值和碳源中麩皮占比的交互作用、初始pH值和發酵時間的交互作用、碳源比例和發酵時間的交互作用對固態發酵產木聚糖酶的影響均不太顯著。同時響應曲面光滑，均有最高點，說明均存在最大值。

2.3 驗證試驗及工藝條件的確定

利用軟件Design Expert 8.0.6.1得到回歸模型預測的枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的最優固態發酵工藝為麩皮占比61.43%，培養時間3.28 d，初始pH值為5.44，此時預測木聚糖酶酶活力為3 507.43 U/g濕基。為便于實際操作，將最優固態發酵工藝修正為麩皮占比60%，培養時間3 d，初始pH值為5.0。在此最優發酵工藝條件下，木聚糖酶酶活力實際值為3 459.58 U/g濕基。與預測值相比，相對偏差為1.36%，從而證實該模型可用于枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶固態發酵工藝優化。

3 結論

通過單因素試驗和響應面試驗優化得到克氏原螯蝦腸道來源枯草芽孢桿菌Z-3產木聚糖酶的最優固態發酵工藝：培養時間3 d、培養溫度37 ℃、初始pH值5.0、裝料量30 g/250 mL，接種量2.5%，碳源為麩皮與玉米芯混合物，麩皮占比60%，氮源為氯化銨，在此最優發酵工藝條件下，木聚糖酶活力為3 459.58 U/g濕基，較初始發酵工藝下的木聚糖酶活力2 079.1 U/g濕基，提高了66.40%。