紅光對安卡紅曲霉GZU4577的調控及其與無機氮源的相關性

趙永霞，周禮紅 *，謝 健，王博語

（1.茅臺學院 釀酒工程系，貴州 仁懷 564507；2.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；3.遵義醫學院遺傳教研室，貴州 遵義 563000）

光是自然界中影響生物體發育和生理過程的重要信號，對真菌的生長發育和代謝產物合成有很大影響[1]。據研究報道，光變化會促使真菌重新編程其1/5的基因來改變生長發育模式，還能對無性或有性發育進行選擇或對代謝產物進行重調[2-4]。如光能夠促進構巢曲霉（Aspergillus nidulans）偏向有性發育，抑制無性發育。不同波長和不同顏色的光對絲狀真菌有著不同的調控模式，紅光抑制頭絨泡菌（Physarum polycephalum）的光碎片化，而遠紅光則促進它的光碎片化[5]。綠僵菌（Metarhizium robertsii）在紅光照射下產生的分生孢子對逆境的耐受最差，而藍光和白光照射下，孢子對逆境的耐受較好[6]。

紅曲霉是中國傳統藥食兼用菌種，可代謝產生多種生物活性物質，廣泛應用于釀酒、制藥等領域，其生長、發育、代謝等也同樣受到光的調控。MIYAKE T等[7]研究發現，叢毛紅曲霉（Monascus pilosus）經不同波長光照處理后，其菌絲的長短、疏密，無性孢子的形成量及有性孢子的萌發都發生相應的改變；BüHLER R M M等[8-9]研究表明，紅光可以促進紅曲霉生長發育和色素產生；CHEN D等[10]研究發現，藍光和照射時長都會影響紅曲霉不同色素的合成。藍光[11]抑制紅曲霉中桔霉素的合成，白光[12]和藍光[13]對紅曲霉的生長發育和次級代謝產物產生的影響與培養基中的氮源密切相關。氮源代謝還受到晝夜節律的調控[14]，藍光可以增強硝酸還原酶的部分亞基活性誘導菌絲向有性發育分化，說明光反應和氮代謝之間存在聯系[15]。岳倩倩等[16]研究發現，銨鹽可以促進紅曲霉的生長發育和代謝，同時，培養基的氮源和pH值也會影響安卡紅曲霉（Monascus anka）的不同色素積累[17]，6-呋喃氨基嘌呤（6-fur-turylaminopurine）可以提高紅色素的產量、色素的光穩定性和發酵液色澤[18]；SHI K等[17]研究發現，硫酸銨為氮源時，Monascus anka胞內色素主要是紅色素，但當以蛋白胨為氮源時，胞內色素主要是黃色素。更換為雞毛蛋白胨，則有利于紫色紅曲霉（Monascus purpureus）所有色素的合成和積累[19]。因此，氮源對紅曲霉的的生長發育和代謝也有重要的影響，而且和光調控存在相關性。

光和氮源對真菌的發育和代謝都有著重要的調控作用，兩者之間也存在密切聯系，但目前結合雙因素對紅曲霉的協同調控研究還不全面，為探究安卡紅曲霉（Monascus anka）GZU4577中光調控與氮源代謝的關系，本研究采用紅光與不同無機氮源相結合的方法，通過菌落觀察、生長測量、分生孢子和閉囊殼合成數量檢測以及色價的測定，研究紅光和氮源對Monascus ankaGZU4577的調控情況，為后續深入研究光與氮源協同調控途徑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

安卡紅曲霉（Monascus anka）GZU4577：本實驗室分離保藏。

1.1.2 培養基

沙氏瓊脂改良培養基：麥芽糖5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，酵母膏5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然，121 ℃高壓滅菌25 min。

無氮源察氏（Czapek）培養基：K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃高壓滅菌25 min。

調控培養基：向無氮源Czapek培養基中分別添加NH4NO310 g/L、NH4Cl 10 g/L、NaNO310 g/L作為氮源。

1.1.3 化學試劑

NH4NO3、NH4Cl、NaNO3（均為分析純）：重慶北碚精細化工廠；K2HPO4、KCl、MgSO4、FeSO4（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；麥芽糖、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏（均為生化試劑）：上海盛思生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F標準型凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DH-360A恒溫培養箱：天津市實驗儀器廠；Motic1300光學顯微鏡：陜西麥迪奧醫藥科技有限公司；YX280B高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；115 cm/28 W單色光源燈管：日本日立公司；Multiskan FC酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養方法

以無氮源Czapek培養基作為對照（CK），將安卡紅曲霉GZU4577接種于沙氏瓊脂改良培養基，30 ℃條件下培養16 h，用無菌水洗下孢子，轉入帶有玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩，充分打散孢子，三層擦鏡紙過濾，經孢子計數，制成終濃度為1×106CFU/mL的均一孢子懸液。取10 μL孢子懸液分別接種于無氮源察氏培養基和調控培養基中心（每組重復3次），分別置于紅光（波長690～700 nm）（光照強度為449.94 Lux）、黑暗條件下，28 ℃連續培養9 d。

1.3.2 形態觀察

每隔24 h拍照，觀察菌落形態、隆起度及變色時間，采用游標卡尺測量菌落直徑，采用光學顯微鏡觀察氣生菌絲、孢子及邊緣菌絲的變化。

1.3.3 色素提取及測定方法

將培養好的安卡紅曲霉GZU4577烘干，測定干質量，研碎，置于帶塞試管中，加入10 mL體積分數為80%的乙醇，避光浸提5 h，獲得色素粗提物。稀釋一定倍數后，置于酶標儀中，分別在波長510 nm、465 nm、410 nm處測定其吸光度值。其中以波長510 nm處的吸光度值代表紅色素，465 nm處的吸光度值代表橙色素，410 nm處的吸光度值代表黃色素。根據吸光度值計算色價，其計算公式如下：

1.3.4 孢子數計數方法

安卡紅曲霉GZU4577培養9 d后，采用內徑為10 mm的打孔器在菌落上均勻打孔，置于含有玻璃珠的三角瓶內，加入10 mL 0.2%Tween80溶液，漩渦振蕩洗孢子，采用顯微鏡計數閉囊殼，四層擦鏡紙過濾后，采用血球計數板對分生孢子進行計數[20]。

1.3.5 分析方法

每個實驗重復3次，使用SPSS Statistics 17.0軟件進行數據分析；采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 紅光結合不同無機氮源對安卡紅曲霉GZU4577生長的影響

紅光結合不同無機氮源對安卡紅曲霉GZU4577生長的影響見圖1、圖2及表1。

圖1 紅光結合不同無機氮源對安卡紅曲霉GZU4577菌落形態的影響Fig.1 Effect of red light combined with different inorganic nitrogen sources on colony morphology of Monascus anka GZU4577

圖2 紅光結合不同無機氮源對安卡紅曲霉GZU4577菌落直徑的影響Fig.2 Effect of red light combined with different inorganic nitrogen sources on Monascus anka GZU4577 colony diameter

表1 紅光結合不同無機氮源對安卡紅曲霉GZU4577菌落形態（28 ℃培養9 d）特征的影響Table1 Effect of red light combined with different inorganic nitrogen sources on Monascus anka GZU4577 colony morphology(culture at 28 ℃for 9 d)

由圖1、圖2及表1可知，與黑暗條件相比，當無氮源添加時，在生長前期（4 d），紅光照射使氣生菌絲較黑暗條件下濃密，隆起度略高，但在生長后期（9 d），紅光照射下菌落較小，氣生菌絲隆起度較低，氣生菌絲稠密程度一致，只是邊緣菌絲略稀薄，氣生菌絲均為淡粉色。當培養4 d時，紅光條件下菌落直徑顯著＞黑暗條件下的菌落直徑（P＜0.05），但隨著培養時間的推移，菌落直徑之間無顯著性差異（P＞0.05），說明在無氮源添加的情況下，紅光不能促進或者抑制菌落的徑向生長，該結果與MIYAKE T等[7]研究結論一致，紅光對菌落大小沒有顯著影響。當添加不同無機氮源后，紅光的影響規律發生變化。當以NaNO3為唯一氮源時，紅光顯著抑制菌落的徑向生長（P＜0.05），培養至9 d時，菌落直徑為15.8 mm，幾乎沒有氣生菌絲，菌苔稀薄，變色時間晚（4 d），說明NaNO3的存在使紅光抑制菌落的生長。當以NH4Cl為唯一氮源時，紅光條件下的菌落形態顏色深紅，而黑暗條件下菌落顏色呈橙色，菌落的氣生菌絲及隆起度與黑暗條件下相近。菌落的徑向生長在黑暗條件下略顯優勢，但是差異不顯著（P＞0.05），菌株邊緣規則，菌落平坦，氣生菌絲生長良好，變色時間短（2 d）。當以NH4NO3為唯一氮源時，黑暗條件下的氣生菌絲非常茂盛，紅光條件下菌落的氣生菌絲遜色于黑暗條件，隆起度也較低。且黑暗條件下菌落邊緣呈放射性扇形，而紅光條件下菌落呈規則圓形。紅光照射下菌落的顏色呈暗紅，而黑暗條件下菌落的顏色更偏橙黃色。培養初期（5 d和6 d）黑暗條件顯著促進菌落的徑向生長（P＜0.05），但是在生長后期（7 d和8 d）紅光和黑暗條件下菌落直徑無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 紅光結合不同無機氮源對安卡紅曲霉GZU4577分生孢子和閉囊殼的影響

紅光結合不同無機氮源對安卡紅曲霉GZU4577分生孢子和閉囊殼的影響見圖3。

由圖3可知，在無氮源添加時，紅光照射條件下，分生孢子和閉囊殼生成量分別為22.53×106CFU/mL、1.39×103CFU/mL；黑暗條件下，分生孢子生成量只有6.57×106CFU/mL，且未檢測到閉囊殼，說明紅光能促進安卡紅曲霉GZU4577分生孢子及閉囊殼的生成，有利于安卡紅曲霉GZU4577分別進入無性生殖和有性生殖。添加無機氮源后，紅光對安卡紅曲霉GZU4577的分生孢子和閉囊殼的影響發生改變，當以NaNO3為唯一氮源時，在紅光條件下，安卡紅曲霉GZU4577的閉囊殼和分生孢子的數量均顯著低于黑暗條件（P＜0.05），說明NO3-的存在下，紅光抑制安卡紅曲霉GZU4577的分生孢子及閉囊殼的生成。當以NH4Cl為唯一氮源時，在紅光條件下，安卡紅曲霉GZU4577的閉囊殼數量顯著低于黑暗條件（P＜0.05），而分生孢子的生成量卻顯著高于黑暗條件（P＜0.05），說明NH4+的存在使得紅光促進了安卡紅曲霉GZU4577的無性發育，抑制有性發育。當以NH4NO3為唯一氮源時，在紅光條件下，安卡紅曲霉GZU4577的閉囊殼和分生孢子量顯著低于黑暗條件（P＜0.05），說明NH4+和NO3-同時存在使得紅光抑制安卡紅曲霉GZU4577的分生孢子和閉囊殼的生成。因此，在一定量無機氮源存在情況下，黑暗有利于閉囊殼的形成，促使安卡紅曲霉GZU4577進入有性生殖，與據文獻報道的黑暗有助于構巢曲霉（Aspergillus nidulans）進入有性繁殖[15]的結論一致。

圖3 紅光結合不同無機氮源對安卡紅曲霉GZU4577分生孢子和閉囊殼量的影響Fig.3 Effect of red light combined with different inorganic nitrogen sources on conidia and cleistothecia of Monascus anka GZU4577

2.3 紅光結合不同無機氮源對安卡紅曲霉GZU4577產色素的影響

紅曲色素是紅曲霉非常重要的次級代謝產物，具有多種生理活性[21]，選擇最佳的色素合成條件具有重要意義。紅光結合不同無機氮源對安卡紅曲霉GZU4577產色素的影響見圖4。

由圖4可知，在無氮源添加時，各色素色價非常低，且紅光與黑暗對色素的積累量沒有顯著影響（P＞0.05）；添加無機氮源后，無機氮源不同，紅光對合成色素的影響不同。當以NaNO3為唯一氮源時，各色素色價非常低，且紅光與黑暗對色素的積累量沒有顯著影響（P＞0.05），但黃色素色價顯著高于無NaNO3添加的條件，說明NaNO3可能對黃色素的合成有特殊促進作用。當以NH4Cl為唯一氮源時，紅光條件下紅色素（125.33 U/g）、橙色素（112.86 U/g）、黃色素（200.66 U/g）的色價均顯著低于黑暗條件下各色素色價（P＜0.05），說明NH4Cl存在時使得紅光抑制色素的合成。當以NH4NO3為唯一氮源時，紅光條件下紅色素（98.99 U/g）、黃色素（149.69 U/g）、橙色素（87.18 U/g）的色價顯著低于黑暗條件下（P＜0.05）。以NH4Cl為唯一氮源時，各色素的色價顯著高于其他試驗組（P＜0.05），相比于NaNO3和NH4NO3，NH4Cl是色素合成的最佳氮源。結果顯示，紅光對色素的色價的影響與是否氮源充足和氮源種類相關。

圖4 紅光結合不同無機氮源對安卡紅曲霉GZU4577產色素的影響Fig.4 Effect of red light combined with different inorganic nitrogen sources on pigment production by Monascus anka GZU4577

3 結論

基于無氮源察氏培養基，在無氮源添加條件下，紅光照射對安卡紅曲霉（Monascus anka）GZU4577徑向生長和各色素的色價無顯著影響（P＞0.05），但顯著促進了分生孢子和閉囊殼的生成（P＜0.05）；添加無機氮源后，紅光對安卡紅曲霉GZU4577的影響機制發生改變：添加NaNO3后，紅光照射顯著抑制安卡紅曲霉GZU4577的徑向生長和分生孢子、閉囊殼的生成（P＜0.05），但對各色素色價無顯著影響（P＞0.05）。添加NH4Cl后，紅光只抑制安卡紅曲霉GZU4577的閉囊殼的生成和各色素的色價（P＜0.05）。添加NH4NO3后，紅光顯著抑制了安卡紅曲霉GZU4577的閉囊殼和分生孢子、紅色素和黃色素的生成（P＜0.05）。因此，紅光對安卡紅曲霉GZU4577的調控與培養基中的氮源存在與否以及氮源種類相關，該研究為安卡紅曲霉GZU4577光調控研究提供了參考，為光信號與營養物質對紅曲霉生長代謝的調控機理研究奠定了基礎。