響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵青梅酒澄清工藝

陳銘中，劉志芳，吳海珍，陳 勇，馮琳燕，鐘旭美*

（陽江職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與環(huán)境工程系，廣東 陽江 529566）

青梅廣泛分布于我國廣東、浙江、江蘇、廣西、云南、福建等地。青梅果不僅營養(yǎng)豐富還具有獨特的藥用價值，有研究表明青梅有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、代謝調(diào)節(jié)、抗骨質(zhì)疏松、免疫增強等作用[1]；除此之外青梅是天然的保健劑，用八九成熟的青梅發(fā)酵的酒能促進新陳代謝，延緩衰老，清除體內(nèi)自由基，抗氧化能力強[2-3]。青梅酒是一種風(fēng)靡中國、韓國和日本的飲料，因其營養(yǎng)價值高，風(fēng)味淳樸，香氣宜人，深受廣大消費者的喜愛。大量研究表明，青梅酒品質(zhì)在發(fā)酵過程和保存中都受到各種因素的影響，如酵母、品種、原料地、發(fā)酵條件、澄清方法，不同條件澄清方法以及酵母篩選的方法都比較局限性。國內(nèi)近幾年對青梅酒的研究偏重于產(chǎn)品工藝研發(fā)，不斷提高其主要分析檢測、藥用價值和提取鑒定的工藝優(yōu)化[4]，國外注重于研究青梅酒工藝優(yōu)化發(fā)酵條件以及發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味成分[5]。目前已有關(guān)于產(chǎn)品工藝條件對青梅酒的品質(zhì)和成分含量影響的報道，如張超等[6]利用菌株RC212、PRLWVER和DV10研究青梅酒酵母的篩選，嚴(yán)紅光等[7]采用明膠、酪蛋白、硅藻土、皂土作為澄清劑研究對青梅酒澄清的影響，多數(shù)以復(fù)合澄清劑為主。本研究充分利用陽江市陽春地區(qū)的特色農(nóng)產(chǎn)品青梅，釀造出口感獨特的青梅果酒，為提升青梅果酒的品質(zhì)和穩(wěn)定性，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對青梅酒進行澄清工藝優(yōu)化的研究，探索最佳的澄清工藝參數(shù)，為青梅的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青梅：陽江市陽春地區(qū)果園；青梅酒：本食品加工實驗室發(fā)酵。

殼聚糖、檸檬酸：宏大生物科技有限公司；果膠酶、維生素C、纖維素酶：上海源葉生物科技有限公司；RC212酵母、焦亞硫酸鉀：煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

I3紫外可見分光光度計：濟南海能儀器有限公司；FA224電子天平：上海舜宇恒平科技儀器有限公司DK-S24恒溫水溶鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TGL-18臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；KQ-250E超聲清洗器：昆明市超聲儀器有限公司；PHSJ-3F pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青梅酒的加工工藝流程及操作要點

原料預(yù)處理：挑選無病蟲害、無霉變、無落地果、果實飽滿，果肉形體完整，肉質(zhì)爽口，略帶苦澀、七八分熟的青果，青梅果香味純正，關(guān)于成熟的青梅會使果酒變渾濁，且影響果酒的芳香；將挑選好的鮮果用清水細(xì)心清果皮上的泥土、雜質(zhì)，清洗時對青梅進行再次挑選，清洗好的青梅果要用涼白開漂洗2次[8]。

破碎打漿：人工衛(wèi)生去核，迅速將青梅果肉投入含0.5%維生素C（抗氧化，防褐變）的涼白開水浸泡，按照青梅和水料液比1∶2（g∶mL）加涼白開水，再加入焦亞硫酸鉀（防止氧化，抑制雜菌生長）混合打漿1 min左右得到青梅汁[9]。

酶解處理：添加0.12%的復(fù)合酶（果膠酶、纖維素酶比例為1∶1），在室溫條件下協(xié)同處理青梅汁8 h，進行酶解[10]。

RC212酵母的活化[11]：酵母粉按照料液比1∶20（g∶mL）溶于2%糖水中，38 ℃恒溫水浴活化30 min后，投入發(fā)酵使用。

成分調(diào)配：添加白砂糖對青梅汁的糖度和酸度進行調(diào)配，使其酸甜適中，使可溶性固形物含量達(dá)到18%，控制pH值為3.5條件下發(fā)酵，可抑制其他雜菌繁殖。

主發(fā)酵：將調(diào)配好的青梅汁以1 000 mL的三角瓶為發(fā)酵容器，裝液量為70%，酵母菌的接種量為5%，將接好酵母的青梅汁于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行主發(fā)酵，定時觀察，以確保發(fā)酵正常進行。主發(fā)酵時間15 d。

后發(fā)酵：將過濾好的青梅果酒在20 ℃的恒溫恒濕箱條件下，密閉容器中貯藏（陳釀）1個月。

澄清、過濾：在陳釀好的青梅酒中加入殼聚糖，澄清后再次過濾。

調(diào)配：利用白砂糖和碳酸鈣進行青梅果酒的酸甜調(diào)配。

貯藏：將調(diào)配過濾好的青梅果酒罐裝，密封，在60～70℃熱水殺菌30 min，冷卻取出，即得青梅果酒成品，在10 ℃低溫貯藏[12]。

1.3.2 澄清工藝優(yōu)化單因素試驗[13-15]

以青梅酒透光率為評價指標(biāo)，在殼聚糖添加量分別為0、4 g/L、8 g/L、12 g/L、16 g/L、20 g/L，pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，澄清時間分別為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d，在澄清溫度為25 ℃條件下，考察殼聚糖添加量、pH值、澄清時間對青梅酒品質(zhì)的影響。

1.3.3 澄清工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化澄清工藝，以殼聚糖添加量（A）、澄清時間（B）、pH值（C）3個因素為自變量，以透光率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，進行3因素3水平的優(yōu)化設(shè)計，Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗做3次平行測定，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式表示，數(shù)據(jù)采用Origin Pro 2019b繪圖，響應(yīng)面法采用Design Expert 10.0.3軟件進行設(shè)計和統(tǒng)計分析，SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 青梅酒澄清工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 殼聚糖添加量對青梅酒澄清的影響

圖1 殼聚糖添加量對青梅酒透光率的影響Fig.1 Effect of chitosan addition on transmittance of plum wine

由圖1可知，青梅酒的透光率隨著殼聚糖添加量在4～16 g/L范圍內(nèi)的增加而增大，當(dāng)殼聚糖添加量為16 g/L時，透光率達(dá)到最高值為93.4%，但當(dāng)殼聚糖添加量＞16 g/L之后，青梅酒透光率反而下降，這是由于殼聚糖是天然的陽離子性絮凝劑，而果酒中含有大量帶負(fù)電荷的纖維素、果膠、單寧等微小顆粒，混合后依靠靜電作用，果酒中的微小顆粒會纏繞于有線性分子結(jié)構(gòu)的殼聚糖，使微小顆粒變成大顆粒逐漸沉降，從而使果酒澄清，若濃度過低形成顆粒物少，沉降速度則慢；若濃度過高，易使體系中黏度增大，果酒中懸浮的顆粒物難以沉降[16]。因此，殼聚糖的最佳添加量為16 g/L。

2.1.2 pH值對青梅酒澄清的影響

圖2 pH值對青梅酒透光率的影響Fig.2 Effect of pH on transmittance of plum wine

由圖2可知，pH值在3.0～4.5范圍時，其透光率隨著pH增加而增大，在pH值4.5時透光率達(dá)到最大值91.3%，pH值再提高，該酒的透光率下降。因為殼聚糖分子氨基在酸性環(huán)境中帶正電荷，與青梅酒中的負(fù)電荷物質(zhì)產(chǎn)生中和作用[17]，產(chǎn)生凝聚作用從而使青梅酒澄清，青梅酒中的pH值的高低還會影響殼聚糖分子中的游離氨基的數(shù)量，從而影響殼聚糖對青梅酒膠體物質(zhì)的絮凝效果。因此，最佳pH值為4.5。

2.1.3 澄清時間對青梅酒澄清的影響

圖3 澄清時間對青梅酒透光率的影響Fig.3 Effect of clarification time on transmittance of plum wine

由圖3可知，青梅酒透光率隨著澄清時間在1～4 d范圍內(nèi)的延長逐漸增大，在澄清時間第4天透光率達(dá)到最高92.1%后，澄清時間超過4 d之后，透光率反而下降。這是由于殼聚糖與青梅酒中的負(fù)電荷物質(zhì)相互作用產(chǎn)生絮凝沉淀物質(zhì)需要一段時間[18-19]，但放置時間過長，又會有部分絮凝物重新溶于溶液。因此，最佳澄清時間為4 d。

2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化設(shè)計與結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面模型建立及顯著性分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以殼聚糖添加量、pH值、澄清時間3個因素進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。以殼聚糖添加量（A）、澄清時間（B）及pH（C）為自變量，以透光率（Y）為響應(yīng)值。響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案及結(jié)果見表2，模型方差分析見表3。

對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到自變量與透光率（Y）的二次多項回歸方程，Y=96.18-2.11A+3.45B-4.39C+3.17AB+2.35AC-0.13BC-3.62A2-2.79B2-5.56C2

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，模型的P＜0.000 1，達(dá)到極顯著，說明響應(yīng)面法得到的模型可靠；失擬項P值為0.147 7＞0.05，表明失擬項不顯著，沒有失擬現(xiàn)象；A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2對結(jié)果影響達(dá)到極顯著性水平（P＜0.01），BC對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05），由F值可知影響青梅酒殼聚糖不同條件澄清的因素大小順序為C（pH）＞B（澄清時間）＞A（殼聚糖添加量），在因素交互作用的條件中，AB的交互作用對青梅酒澄清的效果最好，該模型的決定系數(shù)R2=0.995 1，模型調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.988 7，說明該模型擬合程度高，預(yù)測值能較好反映實際值[20]。

2.2.2 各影響因素的交互作用分析

殼聚糖添加量（A）、澄清時間（B）、pH值（C）3各因素之間交互作用的響應(yīng)面及等高線見圖4。響應(yīng)面越陡表示交互作用越強，等高線形狀呈橢圓；響應(yīng)面越平表示交互作用越弱，等高線形狀越圓[21]。由圖4a、圖4b可以看出，響應(yīng)面的曲面坡度陡峭，等高線呈橢圓形，說明AB、AC之間的交互作用對青梅酒透光率的影響極顯著（P＜0.01），由圖4c可以看出，響應(yīng)面的曲面坡度較平，等高線較圓，BC的交互作用對青梅酒透光率的影響不顯著（P＞0.05）[22]。

圖4 殼聚糖添加量、澄清時間及pH值交互作用對青梅酒透光率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between chitosan addition,clarification time and pH on transmittance of plum wine

2.2.3 最優(yōu)澄清工藝與驗證

經(jīng)Design-Expert10.0.3優(yōu)化，采取軟件優(yōu)化得出在所選試驗因素最優(yōu)條件為殼聚糖添加量為15.505 0 g/L，澄清時間4.852 9 d，pH值為4.312 5，在此條件下青梅酒的透光率預(yù)測值為98.0%。考慮實際操作的可行性，修正最優(yōu)澄清條件為殼聚糖添加量15.5 g/L，澄清時間5 d，pH值為4.3。在此優(yōu)化條件下，進行3次平行驗證試驗，青梅酒透光率的均值為97.4%，與預(yù)測值接近，說明響應(yīng)面優(yōu)化法模型可靠[23]。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗確定了發(fā)酵型青梅酒的澄清最佳工藝條件為殼聚糖添加量15.5 g/L、澄清時間5 d、pH值為4.3。在此優(yōu)化條件下，透光率為97.4%。通過響應(yīng)面試驗進行澄清工藝優(yōu)化，得到一種營養(yǎng)價值高、保健效果和口感俱佳的青梅酒，帝伯仕RC212酵母可作為青梅酒發(fā)酵工業(yè)化的一種參考發(fā)酵劑。