響應面法優化皮狀絲孢酵母產油脂發酵培養基

許鵬飛，程志敏，胡裕升，朱玉博，楊 錕，任立偉，龔大春*

（1.三峽大學 中國輕工業功能酵母重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學 湖北省生物酵素工程技術研究中心，湖北 宜昌 443002）

微生物油脂是酵母、藻類等微生物在一定條件下將碳水化合物轉化而生成的一種特殊脂肪酸甘油酸三脂[1]。其成分以C16和C18為主，可作為生物柴油的原料。利用微生物發酵生產油脂不僅成本低，而且可進行大規模培養[2]，這樣便可避免為了生產生物柴油而與人爭糧爭地的情況[3-4]。

但現階段微生物油脂的產量還不能滿足產業化要求[5]，因此目前主要從菌種的改造[6]和發酵培養優化[7]來提高其產量。利用響應面法優化培養基來獲得更高的油脂產量是一種高效可行的策略。鐘琦等[8]利用響應面優化粘性酵母的發酵條件，使菌株油脂產量達到5.2 g/L；KARPAGAM R等[9]通過響應面設計，將菌株的油脂產量從365 mg/L提升至580 mg/L。

本試驗以前期誘變得到的高產油脂酵母[10]為出發菌株，利用單因素試驗考察菌株產油脂的碳、氮源成分及含量，并通過添加外源因子來調節油脂合成途徑。再對單因素得到的最佳條件進行響應面試驗，進一步優化菌株產油脂的發酵培養基成分，以期為進一步提高油脂產量提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

皮狀絲孢酵母（Trichosporon cutaneum）：實驗室前期常壓室溫等離子體（atmospheric room temperature plasma，ARTP）誘變所得，保存于中國典型培養物保藏中心（China CenterforTypeCultureCollection，CCTCC），保藏號為CCTCC M 2018318。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、麥芽糖、MgSO4、Na2HPO4、KH2PO4、NH4C1、MgCl2、Na2SO4、氯仿、甲醇（均為分析純）：科密歐化學試劑有限公司；酵母浸粉、酵母浸膏、麥芽浸粉、蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

酵母膏胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）瓊脂培養基：酵母膏1 g/L，蛋白胨2 g/L，葡萄糖2 g/L，瓊脂粉2 g/L。

種子液培養基[11]：蔗糖25 g/L，酵母浸膏6 g/L，麥芽浸粉5 g/L，Na2HPO44 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。

發酵培養基[12]：葡萄糖70 g/L，酵母浸粉0.75 g/L，NH4C1 0.1 g/L，MgCl21 g/L，Na2SO40.1 g/L。

1.2 儀器與設備

JJ-CT-ZA潔凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SX-700自動滅菌鍋、MX-307落地高速冷凍離心機：日本TOMY公司；LRH-250A生化培養箱：上海一恒科技有限公司；ZQLY-180振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

將甘油管保藏的菌株用竹簽接種到YPD平板培養基上，28 ℃培養2 d。

1.3.2 種子液培養

挑取平板上的單菌落接種到裝液量為100 mL/250 mL種子液培養基中，并用8層紗布封口處理，在28 ℃、200 r/min的搖床中培養18 h。

1.3.3 發酵培養

將生長處于對數期的種子液，按10%的接種量，接種到基礎發酵培養基中，于28 ℃、200 r/min的搖床中培養7 d。

1.3.4 生物量測定與油脂提取

將發酵培養7 d的發酵液，準確吸取30 mL于烘干稱質量的離心管中，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入適量去離子水重懸，離心去上清。放入100 ℃烘箱中，烘干至恒質量，計算生物量。按每克菌體加入8 mL 的8 mol/L鹽酸，搖勻后室溫靜置1 h，再進行沸水浴加熱10 min，冷卻后再沸水浴5 min[13]。待溫度降至室溫后，加入氯仿和甲醇溶液進行多次萃取，將收集到的氯仿層蒸發除去氯仿，得到微生物油脂[14-15]。生物量和油脂產量的計算公式如下：

1.3.5 單因素試驗

利用單因素試驗，考察發酵培養基中的碳源（蔗糖、阿拉伯糖、木糖、麥芽糖）、氮源（酵母浸粉、氯化銨、蛋白胨、玉米漿干粉、硫酸銨）、外源因子（乙酸鈉、蘋果酸）對油脂積累的影響，得出最佳的碳源、氮源與外源因子后，研究其最佳添加量。在進行單因素試驗時，其他條件保持不變。

1.3.6 響應面試驗對油脂積累條件的優化

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

結合單因素試驗結果，利用Box-Behnken試驗，設計3因素3水平響應面試驗方案，最后對所得到的預測條件進行驗證。響應面試驗因素水平見表1。

2 結果與分析

2.1 皮狀絲孢酵母生長曲線

圖1 皮狀假絲酵母生長曲線Fig.1 Growth curve of Trichosporon cutaneum

皮狀絲孢酵母的生長曲線如圖1所示。由圖1可知，在接種后的8 h內，菌體一直處于遲緩期，在此階段菌體不斷適應新的培養環境，菌體數量基本保持不變；在8～20 h時，菌體經過前期的適應準備，在此時期菌體此時期菌體生長速率達到最大，數量極速增長；在20 h以后，菌體生長緩慢，基本處于穩定期。因此，選擇培養18 h左右生長旺盛的菌種作為轉接的種子液。

2.2 培養基優化單因素試驗

2.2.1 碳源種類及對皮狀絲孢酵母油脂積累的影響[16]

圖2 碳源種類對油脂積累的影響Fig.2 Effect of carbon source types on oil accumulation

從圖2可以看出，皮狀絲孢酵母可以利用六碳糖、五碳糖、雙糖等碳源進行發酵生成油脂，這將有利于其利用木質纖維素水解產物來進行生物轉化。當使用葡萄糖、蔗糖、木糖發酵時，菌株的生長相差不大，但在油脂積累方面，木糖的產油能力明顯低于葡萄糖，這可能與木糖的復雜代謝相關[17]。用葡萄糖培養時，菌株不管是在生物量還是油脂產量方面都高于其他碳源，這與微生物對葡萄糖的偏好性以及葡萄糖可直接糖酵解產生丙酮酸而進行油脂合成有關[18]。因此，選擇葡萄糖作為碳源來進行后續的發酵培養。

2.2.2 葡萄糖添加量對皮狀絲孢酵母油脂積累的影響

圖3 葡萄糖添加量對油脂積累的影響Fig.3 Effect of glucose addition on oil accumulation

從圖3可以看出，在葡萄糖添加量為50～90 g/L時，隨著葡萄糖添加量的增大，菌體的生物量和油脂產量都呈上升趨勢。當葡萄糖添加量為50 g/L時，其油脂產量僅為2.7 g/L，油脂系數僅為5.5 g/100 g；而當葡萄糖添加量提升至90 g/L時，其油脂產量達到了7.2 g/L，油脂系數達到了8.6 g/100 g，可見葡萄糖對菌株的油脂積累有很大影響。但當葡萄糖添加量繼續增大時，菌株的生物量、油脂產量均出現了降低，在葡萄糖添加量為150 g/L時，油脂系數為4.2 g/100 g，較葡萄糖添加量為90 g/L時，降低了50%，可見高濃度的葡萄糖抑制了菌株的生長和油脂積累。因此，最佳葡萄糖添加量90 g/L。

2.2.3 氮源對皮狀絲孢酵母油脂積累的影響

圖4 氮源種類對油脂積累的影響Fig.4 Effect of nitrogen source types on oil accumulation

由圖4可以看出，在用無機氮源培養時，菌株的生長和油脂產量均較差，僅有5.5 g/L的生物量和2.9 g/L的油脂產量，而用有機氮源進行培養時，菌株生長狀況良好，而且油脂的積累量大，當氮源為玉米漿干粉時，菌株的生物量、油脂產量和油脂系數分別達到了15.2 g/L、9.3 g/L和10.3g/100 g。這可能是因為玉米漿干粉中含有豐富的蛋白質、氨基酸、無機鹽和生長因子等成分[19-20]，易于被菌株利用。

2.2.4 玉米漿干粉添加量對皮狀絲孢酵母油脂積累的影響

圖5 玉米漿干粉添加量對油脂積累的影響Fig.5 Effect of corn syrup dry powder addition on oil accumulation

從圖5可以看出，玉米漿干粉添加量對細胞的生長有很大影響，隨著玉米漿干粉的添加量增加，細胞的生物量從18 g/L提高至25 g/L。但其油脂產量并沒有和生物量正相關，而是在添加量為4 g/L的玉米漿干粉添加量時油脂產量達到了最大。在玉米漿干粉添加量更高時，菌株主要表現為生物量的增加，此時，培養基中的碳源大部分用于了細胞的生長和非油脂合成代謝過程，出現了油脂產量降低的情況。這說明氮源的用量在高濃度區域時，生物量與油脂的合成屬于非正相關。因此，最適玉米漿干粉添加量為4 g/L。

2.2.5 外源因子對皮狀絲孢酵母油脂積累的影響[21-22]

圖6 乙酸鈉添加量對油脂積累的影響Fig.6 Effect of sodium acetate addition on oil accumulation

乙酰輔酶A是脂肪酸合成和能量代謝的關鍵物質，乙酸鈉可以為乙酰輔酶A的合成提供前體物質，從而提高乙酰輔酶A水平[23]，進而可以使脂肪酸合成有更多的底物供應[24]。由圖6可知，當乙酸鈉的添加量為0.1 g/L時油脂的積累有少量提高，當繼續增大添加量后，乙酸鈉對菌株產生了一定的毒性[25]，使菌株油脂積累能力明顯下降。

圖7 蘋果酸對油脂積累的影響Fig.7 Effect of malic acid addition on oil accumulation

脂肪酸合成的另一個關鍵物質就是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）[26]，其主要來源于蘋果酸酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶。蘋果酸酶可催化蘋果酸氧化脫羧生成丙酮酸，在此過程中便可生成NADPH，用于脂肪酸合成[27-28]。在培養基中添加微量的蘋果酸來增加催化底物，從而產生更多的還原力，由圖7可知，將蘋果酸添加到培養基中對油脂積累沒有明顯的影響，甚至在高濃度時對微生物的油脂積累出現了抑制效果，這可能是蘋果酸的添加影響了發酵液的pH。

2.3 響應面優化試驗

2.3.1 響應面優化試驗設計及結果

根據單因素試驗的結果，選取葡萄糖添加量（A）、玉米漿干粉添加量（B）和乙酸鈉添加量（C）3個因素進行響應面優化設計，以油脂產量（Y）為響應值進行試驗，結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.3.2 模型建立與方差分析

利用Design Expert 8.0軟件對表2的結果進行回歸分析，得到回歸方程：Y=14.02+1.34A+0.74B-0.2C+0.95AB+0.025AC-0.025BC-2.24A2-1.48B2-0.91C2，而且決定系數R2=0.994 6表示有99.46%的數據可以用該模型來解釋，調整決定系數說明該方程的擬合性較好，可以用來進行分析。

對回歸方程進行方差分析，結果見表3。由表3可看出，模型P＜0.000 1表明此模型極顯著，失擬項P=0.075 9＞0.05，說明失擬項不顯著。回歸方程中葡萄糖和玉米漿干粉的一次項P＜0.000 1，達到了極顯著的水平，說明在試驗范圍內這兩個因素對油脂的積累有極顯著性的影響。在交叉項中葡萄糖和玉米漿干粉的交互作用（AB）對油脂影響極顯著（P＜0.000 1），二次項中三個因素對油脂的積累影響均極顯著（P＜0.000 1）。

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

2.3.3 響應面圖分析

各因素交互作用對菌株發酵油脂產量結果的影響見圖8。由圖8可知，當3個因素中其中一個固定為零水平時，其他兩個因素存在交互作用且存在一個油脂產量最大的組合點[29]。在3組交互影響的圖中，可以看出當其中一個因素固定時，隨著另一因素的增大，油脂產量呈現先增大后減小的趨勢。

2.3.4 響應面預測與驗證

對得到的回歸方程求解油脂產量的極大值，得出培養基起始葡萄糖、玉米漿干粉、乙酸鈉的添加量分別為：97.6 g/L、4.4 g/L、0.09 g/L時，預測的菌株油脂產量可達14.4 g/L。在此條件下進行3組平行試驗，得出平均油脂產量實際值為14.4 g/L，與預測值相吻合。說明本次實驗的模型對皮狀絲孢酵母發酵產油脂具有一定的指導意義。

圖8 各因素交互作用對油脂積累影響的響應面和等高線Fig.8 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on oil accumulation

3 結論

本研究以微生物油脂產量為目標，通過單因素試驗及響應面試驗進行設計優化，建立了一個油脂產量與三個因素的數學模型，此模型能很好的擬合實驗結果，其預測條件與驗證實驗基本吻合。得到皮狀絲孢酵母發酵產油脂的最優發酵培養基為：葡萄糖97.6 g/L、玉米漿干粉4.4 g/L、乙酸鈉0.09 g/L。在此條件下菌株的油脂產量達到了14.4 g/L。玉米漿干粉的加入大大促進了菌體的生長，本研究對生物油脂產業化生產提供一定科學依據。