復合澄清劑處理柚子發酵酒的澄清效果研究

趙玲燕，譚曉輝，龍運忠，胡鵬剛 *，婁興維，江飛鳳，潘雪梅

（1.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；3.荔波昌輝食業有限公司，貴州 荔波 558400）

柚子（Citrus grandis）屬蕓香科柑橘屬植物，具有“天然水果罐頭”的美稱[1-3]。其果實酸甜可口，含有多種氨基酸、β-胡蘿卜素、抗壞血酸、煙酸等豐富營養成分；具有很高的藥用價值，如抗衰老、抗氧化、抗癌、降血糖、降血壓、降血脂等功效，備受消費者的青睞[4-6]。柚子發酵而成的柚子果酒因含有柚子中多種有益微量元素，不僅口感好，且具營養保健的特點，市場前景看好。

剛發酵出的柚子果酒中富含蛋白質、大量果膠質和纖維素等物質[7-8]，在儲存過程中會出現渾濁、沉淀、失光等現象，嚴重影響柚子果酒的感官品質，因此，需要對發酵出的柚子果酒進行澄清處理。而澄清劑被廣泛應用于其他果酒的澄清研究，澄清劑不僅處理效果好，還能最大程度的保留果酒中的有益物質，使果酒保留原有的色香味。澄清劑的澄清機理、性質和特點不同都會影響果酒的澄清效果[9]，硅藻土可以吸附果酒中一定的果膠、色素、酵母菌等固體懸浮物[10-11]；殼聚糖可與酒體溶液中帶負電荷的微粒相互作用，使酒液渾濁的蛋白質、果膠、單寧等膠態顆粒絮凝沉淀[12]；木瓜蛋白酶可使果酒中大分子蛋白質降解為小分子的化合物，從而達到澄清效果[13-14]；明膠能與單寧作用生成一種粘糊狀的化合物，吸附酒中的渾濁微粒[9，15]；交聯聚乙烯吡咯烷酮（crosslinking polyvingypyrrolidone，PVPP）粒子間存在許多褶皺和微孔，可用于吸附澄清[16]；皂土能與酒中帶正電荷的蛋白、多酚類物質結合，起到除蛋白、除酚作用[17]。同時復合澄清劑綜合了多種澄清劑的優點，比單一澄清劑澄清效果好[18]。

本試驗擬采用復合澄清劑法對柚子果酒進行澄清研究。首先研究硅藻土、殼聚糖、木瓜蛋白酶、明膠、PVPP和皂土6種單一澄清劑對柚子酒的澄清效果，然后從中選取澄清效果較好的澄清劑進行復合試驗，采用正交試驗分析復合澄清劑配比、處理溫度和處理時間對柚子果酒澄清效果的影響，獲得最佳的澄清工藝，為后續柚子果酒研究和規模化生產柚子果酒提供一定的的技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柚子發酵酒：貴州荔波昌輝食業有限公司；皂土、PVPP（食品級）：煙臺帝伯仕自釀機有限公司；木瓜蛋白酶（食品級，酶活力100 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；可溶性殼聚糖、明膠（食品級）：萬利達生物科技有限公司；硅藻土（食品級）：云南省騰沖縣助濾劑廠；氫氧化鈉：天津市永大化學試劑有限公司；硫酸：重慶川江化學試劑廠；無水葡萄糖：天津市協和昊鵬色譜科技有限公司；次甲基藍、酚酞：天津市化學試劑供銷公司；鹽酸：四川西隴化工有限公司。試驗所用化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JJ224 BC型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；723可見分光光度計：天津冠澤科技有限公司；DH5000 Ⅱ型恒溫培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；DFDS-700型恒溫水浴鍋：天津市萊悅納格實驗室儀器銷售有限公司；50型附溫度計密度瓶：海門市測溫儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 澄清劑的配制

1%殼聚糖溶液：準確稱取1.0 g殼聚糖，加入97.0 mL去離子水加熱溶解，再加入2.0 mL冰醋酸，緩慢加熱溶解，邊加熱邊攪拌，使之溶解冷卻備用。

4%皂土懸濁液：準確稱取4.0 g皂土，用96.0 mL去離子水浸泡24 h后充分攪拌，配成懸浮液備用。

1%明膠溶液：準確稱取1.0 g明膠，用99.0 mL去離子水浸泡過夜，緩慢加熱溶解，邊加熱邊攪拌，冷卻備用。

4%硅藻土溶液：準確稱取4.0 g硅藻土，用96.0 mL水浸泡，配成懸浮液。

2%PVPP溶液：準確稱取2.0 g PVPP，用98.0 mL去離子水浸泡過夜，緩慢加熱溶解，冷卻備用。

1%木瓜蛋白酶溶液：準確稱取1.0 g木瓜蛋白酶，用99.0 mL去離子水浸泡過夜，配成1%木瓜蛋白酶溶液備用。

1.3.2 單一澄清劑的確定試驗

表1 6種澄清劑單因素試驗水平Table 1 Levels of single factor experiments of 6 clarifying agents

經預試驗后，取20.0 mL柚子果酒樣品于比色試管中，分別按表1試驗方案加入澄清劑，充分混勻后，在室溫條件下靜置12 h后，取上清液在波長640 nm處測其透光率（下同），確定各澄清劑最佳添加量，并對最佳添加量條件下的柚子果酒進行感觀品鑒。

1.3.3 復合澄清劑試驗

（1）單因素試驗

配比的確定：根據1.3.2研究結果，取皂土和殼聚糖作為復合澄清劑，取20.0 mL柚子果酒于比色管中，分別按皂土和殼聚糖質量比為0.50∶1、1.00∶1、1.50∶1、2.00∶1、2.50∶1、2.57∶1、3.00∶1、3.50∶1、4.00∶1加入（總添加量2.5 g/L），混合均勻，在室溫下靜置12 h，取上清液測定其透光率。

澄清溫度的確定：根據上述試驗所得出的結果，取20.0 mL柚子果酒于比色管中分別于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃溫度條件下靜置12 h后，取其上清液測定透光率。

澄清時間的確定：取20.0 mL柚子果酒于比色管中，添加皂土-殼聚糖復合澄清劑后，在最佳溫度下靜置4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h，取其上清液測定透光率。

（2）正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以透光率作為評價指標，選擇復合澄清劑配比（A）、處理溫度（B）和處理時間（C）作為考察因素，依照L9（33）進行3因素3水平正交試驗。正交試驗的因素與水平見表2。

表2 澄清工藝優化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for clarification technology optimization

1.3.4 分析方法及理化指標的測定

總糖：斐林試劑法[19]；總酸（以酒石酸計）：酸堿指示劑法[19]；酒精度：密度瓶法[19]；澄清度的測定：以蒸餾水為參比，于640 nm波長處測其透光率；感官評定：成立5人小組，以百分制進行感官評價，去掉最高分和最低分，取其平均值作為最終評分，其中評分標準參考羅光琳[20]的文獻。

2 結果與分析

2.1 單一澄清劑的確定試驗

2.1.1 硅藻土添加量對柚子果酒澄清效果的影響

由圖1可知，隨著硅藻土添加量增加，柚子果酒的透光率總體呈現出先增加后減少，最終趨于穩定的趨勢。當硅藻土添加量從0.2 g/L增加至0.8 g/L時，柚子果酒透光率迅速上升至最大值71.6%。其后，隨添加量的增加，透光率逐漸降低且趨于穩定。

圖1 硅藻土添加量對柚子果酒澄清的影響Fig.1 Effect of f diatomite addition on clarification of grapefruit wine

2.1.2 殼聚糖添加量對柚子果酒澄清效果的影響

由圖2可知，在殼聚糖添加量的范圍內，透光率先隨殼聚糖添加量的增大而增大后呈平穩的趨勢。殼聚糖添加量從0.4 g/L增加至0.7 g/L時，柚子果酒的透光率逐漸增大；當添加量為0.7 g/L時，透光率達82.2%，后趨于穩定。

2.1.3 木瓜蛋白酶添加量對柚子果酒澄清效果的影響

由圖3可知，隨著木瓜蛋白酶添加量逐漸增加，柚子果酒透光率總體呈現先增加后降低的趨勢。木瓜蛋白酶添加量在0.1～0.6 g/L范圍內時，透光率逐漸增大；當添加量為0.6 g/L時，透光率達到最大值61.7%；其后，透光率隨著添加量的增加而降低。

圖3 木瓜蛋白酶添加量對柚子果酒澄清的影響Fig.3 Effect of papain addition on clarification of grapefruit wine

2.1.4 明膠添加量對柚子果酒澄清效果的影響

由圖4可知，明膠對柚子果酒的澄清效果不明顯，澄清處理后的柚子果酒最大透光率僅有63.8%。在明膠添加量在0.05～0.20 g/L范圍內時，柚子透光率明顯增加；在0.20～0.35 g/L范圍內時，透光率逐漸降低。

圖4 明膠添加量對柚子果酒澄清的影響Fig.4 Effect of gelatin addition on clarification of grapefruit wine

2.1.5 PVPP添加量對柚子果酒澄清效果的影響

由圖5可知，隨著PVPP添加量的增加，柚子果酒的澄清度在0.1～0.7 g/L范圍內時透光率逐漸升高，當PVPP添加量為0.7 g/L時，透光率最大為73.6%；添加量大于0.7 g/L時，透光率開始降低。

圖5 PVPP添加量對柚子果酒澄清的影響Fig.5 Effect of PVPP addition on clarification of grapefruit wine

2.1.6 皂土添加量對柚子果酒澄清效果的影響

圖6 皂土添加量對柚子果酒澄清的影響Fig.6 Effect of bentonite addition on clarification of grapefruit wine

由圖6可知，在整個皂土的處理范圍內，隨著添加量的增加，柚子果酒的澄清度在逐漸的升高，添加量達到1.8 g/L后，透光率趨于穩定。這可能是因為在澄清處理前期中帶有負電荷皂土膠體微粒吸附果酒中帶有正電荷的物質（如纖維素，蛋白質及含氮物質等），所以澄清效果明顯；但是當皂土的添加量到最優值時，整個果酒體系已經達到了一個吸附平衡狀態，即使再添加皂土，果酒的透光率變化也很小。取1.8 g/L作為皂土的最佳添加量，此時透光率為84.8%。

2.1.7 6種澄清劑對柚子果酒澄清效果的比較

6種澄清劑在各自的最佳添加量條件下對柚子果酒澄清效果的比較見圖7所示。

圖7 6種澄清劑對柚子果酒澄清效果的比較Fig.7 Comparison of clarification effects of 6 clarifiers on grapefruit wine

由圖7可知，硅藻土、PVPP和皂土3種澄清劑對柚子果酒有較明顯的作用。皂土的澄清效果最佳，透光率為84.8%，澄清后的感官評分最高，為88分；而綜合透光率（82.2%）和感官評分（85分）殼聚糖澄清效果次之。所以，皂土和殼聚糖是單一澄清劑的首選。相較而言，硅藻土和PVPP雖有較明顯的澄清效果，但綜合透光率和感官評分來看，都沒有皂土和殼聚糖的澄清效果佳，故選擇皂土和殼聚糖為最終的復合澄清劑。

2.2 復合澄清劑優化單因素試驗

2.2.1 復合澄清劑配比對柚子果酒的澄清效果的影響

圖8 皂土-殼聚糖質量比對柚子果酒澄清的影響Fig.8 Effect of bentonite-chitosan ratio on clarification of grapefruit wine

由圖8可知，皂土和殼聚糖質量比在0.50∶1～1.00∶1范圍時，透光率隨著皂土-殼聚糖質量比的增大而增大；在1.00∶1～2.50∶1范圍內，隨著復合澄清劑配比的逐漸增大，透光率呈現下降的趨勢，其中當皂土-殼聚糖質量比為2.57∶1時，透光率為89.1%。當皂土-殼聚糖質量比為1.00∶1時，透光率最大，所以選取的皂土-殼聚糖質量比為1.00∶1，透光率為90.3%。

2.2.2 處理溫度比對柚子果酒的澄清效果的影響

由圖9可知，當處理溫度從20 ℃升高至35 ℃時，柚子果酒的透光率逐漸增大；在35 ℃時透光率達到最大值為90.7%，但處理溫度大于35 ℃時，透光率開始降低。因此，最適宜的處理溫度為35 ℃。

圖9 處理溫度對柚子果酒澄清的影響Fig.9 Effect of treatment temperature on clarification of grapefruit wine

2.2.3 處理時間對柚子果酒的澄清效果的影響

由圖10可知，柚子果酒的透光率隨著處理時間的延長先增大后降低。處理時間在4～12 h之間時，透光率前期明顯增大，后期緩慢增大；當處理時間長于12 h時，柚子果酒透光率逐漸降低。考慮到澄清效果和生產效率問題，選取12 h為最優處理時間，此時透光率為90.8%。

圖10 處理時間對柚子果酒澄清的影響Fig.10 Effect of treatment time on clarification of grapefruit wine

2.3 正交試驗優化復合澄清劑澄清柚子果酒工藝條件

根據上述的單因素試驗結果綜合分析，以柚子果酒透光率為評價指標，選擇皂土-殼聚糖復合澄清劑配比（A）、處理溫度（B）、處理時間（C）3個因素進行正交試驗，試驗結果與分析見表3。

表3 復合澄清劑澄清工藝優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for compound clarifiers clarification process optimization

由表3可知，3個因素對透光率影響程度的大小為A＞B＞C，即皂土-殼聚糖復合澄清劑＞處理溫度＞處理溫度。柚子果酒澄清工藝最佳處理條件為A1B2C1，皂土-殼聚糖復合澄清劑質量比為0.75∶1、處理溫度35 ℃、處理時間11 h。在此最優澄清條件下柚子果酒的透光率為91.7%，感官評分為91分。

2.4 復合澄清劑澄清處理柚子果酒質量評價

由表4可知，澄清處理后的柚子果酒各項理化指標變化不大，透光率顯著提高，澄清后的果酒外觀較清澈透明，感官品評優于未處理前的柚子果酒。

表4 復合澄清劑澄清效果評價比較Table 4 Comparison of clarification effect of compound clarifiers

3 結論

分別采用硅藻土、殼聚糖、木瓜蛋白酶、明膠、PVPP和皂土6種澄清劑對柚子果酒進行澄清研究。結果表明，皂土、殼聚糖、硅藻土三種澄清劑對柚子果酒的澄清效果較好，其中皂土和殼聚糖澄清效果最好。選則皂土和殼聚糖進行復合澄清正交試驗研究，最終獲得柚子果酒澄清的最佳工藝條件為：皂土-殼聚糖澄清劑質量比為0.75∶1、處理溫度35 ℃、處理時間11 h。在此優化下，所得柚子果酒澄清效果最好，透光率可達91.7%，比未使用澄清劑時提高了35.5%，且對果酒酒精度、總糖、總酸影響不大。因此說明皂土-殼聚糖復合澄清劑是一種良好有效的柚子果酒澄清劑，可以為企業規模化生產柚子果酒提供一定的的技術指導。