紅茶菌中醋酸菌和酵母菌的分離鑒定及其相互作用

王潔琛，陳志周*，王 穎，劉 冰，馬倩云

（河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071000）

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是一種具有三維網狀結構的多糖，屬于納米級分子，純度高、結晶度高、機械性能良好、持水能力強、具有可調的表面化學性質，這些特性使其在食品和生物醫藥等領域得到廣泛應用[1-2]。

許多細菌都能夠產生細菌纖維素。細菌纖維素的產生使細菌與富氧表面接觸，保護細胞免受紫外線等不利因素的影響，保持水分，增強定殖能力，還與細菌的趨化性有關[3-4]。不同來源的菌株產生細菌纖維素的能力有所不同，木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）是目前已知的細菌纖維素合成能力最強的菌種[5]。除木醋桿菌外，紅茶菌也具有產生細菌纖維素的能力，產量相對較高[6]。紅茶菌是醋酸菌和酵母菌的共生體，其微生物組成與地理條件、氣候條件和培養基條件有關[7]，但是醋酸菌的種類比較穩定，主要包括Gluconacetobacter、Komagataeibacter、Acetobacter，負責產生細菌纖維素；酵母菌的種類相對豐富，主要包括Brettanomyces、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Schizosaccharomyces[8]。在自然形成的群落中，酵母菌與許多微生物形成了共生關系，如酵母菌通過谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、組氨酸等氨基酸以及某些維生素和輔因子提高乳酸菌的生長速率，促進乳酸菌增殖，而不必進行直接物理接觸[9-12]。

有研究表明，酵母菌的發酵液能夠促進細菌纖維素的合成，推測除了乙醇外還有其他代謝產物在起作用[13]。酵母菌不僅會影響細菌纖維素的合成，而且酵母細胞的疏水性還有助于加強細菌纖維的結構[14]。為了明確紅茶菌中的醋酸菌和酵母菌在產細菌纖維素時的作用關系，對紅茶菌中的醋酸菌和酵母菌進行分離和鑒定，通過純培養和共培養研究酵母菌對醋酸菌產細菌纖維素的影響，為初步了解紅茶菌中微生物間的相互作用以及提高細菌纖維素的產量提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）1.1812：中國普通微生物菌種保藏管理中心。紅茶菌：市售。

1.1.2 試劑

葡萄糖（分析純）：天津市天大化工實驗廠；蛋白胨，酵母浸粉（均為生物試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；納他霉素：阿拉丁試劑有限公司；纖維素酶（15 000 U/g）：國藥集團化學試劑有限公司；基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）預混試劑：天根生化科技有限公司；引物：通用生物系統（安徽）有限公司。

1.1.3 培養基

HS培養基：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.5%，檸檬酸0.115%，十二水合磷酸氫二鈉0.68%，用醋酸將pH調至6.0。

HS平板培養基：在HS培養基的基礎上加入0.1%納他霉素和1.8%瓊脂。

麥芽汁瓊脂培養基：麥芽汁提取物2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.1%，瓊脂1.5%。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose，YPD）：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，自然pH。

糖茶水：大紅袍1%，葡萄糖15%，自然pH。

1.2 儀器與設備

F-1安全智能型反壓高溫蒸煮鍋：北京發恩科貿有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺：北京永光明醫療儀器有限公司；DH-360電熱恒溫培養箱：北京中興偉業有限公司；EPS-300型電泳儀：上海天能科技有限公司；9700型PCR儀：美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化、接種和培養

醋酸菌的活化、接種和培養：將菌種轉接至HS平板培養基上以獲得單菌落，然后在50 mL HS培養基中接種2環菌種，30 ℃靜置培養24 h，作為種子液。采用稀釋涂布平板法對種子液中的醋酸菌進行計數，按照100 mL HS培養基約1×104CFU的比例進行接種，接種完成后30 ℃靜置培養7 d。

酵母菌的活化、接種和培養：將菌種轉接至麥芽汁瓊脂培養基上以獲得單菌落，然后在50 mL YPD培養基中接種4環菌種，30 ℃靜置培養24 h，作為種子液。采用稀釋涂布平板法對種子液中的酵母菌進行計數，按照醋酸菌與酵母菌的比例為1∶1、1∶10、1∶100和1∶1 000在100 mL HS培養基進行接種，接種完成后30 ℃靜置培養7 d。

紅茶菌的活化、接種和培養：在300 mL糖茶水加入40 g紅茶菌膜，30 ℃靜置培養7 d，使用液面新產生的菌膜進行接種，100 mL HS培養基中加入1 g菌膜，接種完成后30 ℃靜置培養7 d。

1.3.2 細菌纖維素產量的測定

培養結束后，將細菌纖維素膜剪碎，稱取1 g碎膜加入9 mL無菌生理鹽水中，同時加入200 μL 3 000 U/mL的纖維素酶進行酶解，酶解完全后在HS平板培養基中進行稀釋涂布以獲得醋酸菌的數量。剩余的碎膜放入稱量瓶中，105 ℃烘干至質量恒定，根據含水率求得細菌纖維素的產量。

1.3.3 紅茶菌中醋酸菌和酵母菌的分離鑒定

在90 mL無菌生理鹽水中加入10 mL紅茶菌發酵液、1 g菌膜和300 μL無菌纖維素酶液，待菌膜完全酶解后進行稀釋，分別涂布在HS平板培養基和麥芽汁瓊脂培養基中，待菌落長出后，挑取形態不同的單菌落反復純化。利用基因組脫氧核糖核酸提取試劑盒對菌株的基因組DNA進行提取，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3'）對醋酸菌的16S rDNA序列進行擴增，NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）對酵母菌的26S rDNA序列進行擴增。PCR反應體系為Mix酶（TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、buffer）26 μL，ddH2O 21 μL，模板1 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL。PCR擴增條件為96 ℃預變性3 min，96 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環，72 ℃再延伸10 min。擴增產物送至通用生物系統（安徽）有限公司進行測序，將測序結果在GenBank中進行基本局部比對搜索工具（basiclocalalignment search tool，BLAST）比對，構建鄰接（neighbor-joining，NJ）法系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 木醋桿菌和紅茶菌細菌纖維素產量的比較

培養7 d后，木醋桿菌和紅茶菌的細菌纖維素產量及醋酸菌的最終數量如表1所示。

表1 培養7 d后木醋桿菌和紅茶菌的細菌纖維素產量及醋酸菌的最終菌落數Table 1 Bacterial cellulose yield and final colony count of Gluconacetobacter xylinum and kombucha after culture for 7 d

由表1可知，紅茶菌的細菌纖維素產量大約是木醋桿菌的5.1倍，而且在初始接種量相同的情況下，紅茶菌中醋酸菌的最終菌落數大約是木醋桿菌的100倍，說明紅茶菌中醋酸菌的增殖速度快于木醋桿菌，從而產生更多的細菌纖維素。紅茶菌中的酵母菌可能對細菌纖維素的產生具有積極作用。

2.2 紅茶菌中醋酸菌分離鑒定

為了確定紅茶菌中醋酸菌的種屬，通過涂布平板法對其進行分離。從紅茶菌中分離出1株醋酸菌，編號A1，其菌落形態見圖1。由圖1可知，菌株A1菌落較小，淡黃色，邊緣不整齊，不透明。利用PCR法擴增得到了A1的16S rDNA序列，測序后，通過BLAST比對，并利用MEGA構建NJ系統發育樹，如圖2所示。

圖1 菌株A1的菌落形態Fig.1 Colonial morphology of strain A1

圖2 菌株A1基于16S rDNA序列的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain A1 based on 16S rDNA sequences

由圖2可知，菌株A1與Komagataeibacter intermedius聚為一支，相似度為99.93%，因此初步鑒定菌株A1為居間駒形桿菌（Komagataeibacter intermedius）。K.intermedius不僅可以耐受高濃度的乙醇和乙酸，而且可以有效的生產細菌纖維素和葡萄糖酸，已被廣泛應用于食品和制藥工業[15]。

為了確定菌株A1是否能夠產生細菌纖維素及產細菌纖維素的能力，將其接種到HS培養基中，靜置培養7 d后測定細菌纖維素產量，以木醋桿菌作為對照，結果如表2所示。

由表2可知，雖然菌株A1的最終菌落數是木醋桿菌的100倍，但是兩者的細菌纖維素產量幾乎相同，說明菌株A1產生細菌纖維素的能力不如木醋桿菌，但是紅茶菌產生的細菌纖維素遠遠多于菌株A1，這表明紅茶菌中的酵母菌能夠極大的促進菌株A1產生細菌纖維素。

表2 菌株A1和木醋桿菌的細菌纖維素產量及最終菌落數Table 2 Bacterial cellulose yield and final colony count of strain A1 and Gluconacetobacter xylinum

2.3 紅茶菌中酵母菌的分離鑒定

為了探究酵母菌對菌株A1的作用，通過涂布平板法對紅茶菌中的酵母菌進行分離。從紅茶菌中分離出3株酵母菌，編號為Y1、Y2和Y3，其中Y1數量最多，為優勢酵母，它們的菌落形態見圖3。

圖3 菌株Y1（a）、Y2（b）、Y3（c、d）的菌落形態Fig.3 Colonial morphology of strain Y1 (a)、Y2 (b)、Y3 (c,d)

由圖3可知，Y1的菌落為白色，圓形，邊緣整齊，側面為山丘狀突起，表面光滑濕潤，不透明；Y2的菌落為白色，圓形扁平狀，邊緣整齊，表面光滑濕潤，不透明；Y3的菌落為白色，圓形，菌落邊緣及背面為栗色，邊緣整齊，菌落中央有圓形突起，表面光滑濕潤，不透明。利用PCR法擴增得到了Y1、Y2和Y3的26S rDNA序列，測序后，通過BLAST比對，并利用MEGA構建NJ系統發育樹，結果如圖4所示。

由圖4可知，菌株Y1與Brettanomyces bruxellensis聚為一支，相似度為99.49%，因此初步鑒定菌株Y1為布魯塞爾酒香酵母（Brettanomyces bruxellensis）；菌株Y2與Zygosaccharomyces bisporus聚為一支，相似度為99.19%，因此初步鑒定菌株Y2為二孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）；菌株Y3與Metschnikowiafructicola聚為一支，相似度為99.43%，因此初步鑒定菌株Y3為核果梅奇酵母（Metschnikowia fructicola）。Brettanomyces和Zygosaccharomyces通常被認為是腐敗酵母，對低pH值、高乙醇濃度和高滲透壓具有耐受性[16-17]，這使得其非常適合紅茶菌發酵液的環境。Metschnikowia常被用作拮抗酵母，用于控制水果和蔬菜上的病原體[18]。通過激活宿主防御機制，提高苯丙烷代謝途徑中一系列酶的表達水平達到控制病原體的效果[19]。

圖4 菌株Y1、Y2和Y3基于26S rDNA序列的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain Y1,Y2 and Y3 based on 26S rDNA sequences

2.4 酵母菌對細菌纖維素產量的影響

為了探究菌株Y1對菌株A1產細菌纖維素的影響，按照不同的比例將兩者接種在HS培養基中共培養，靜置培養7 d后收獲細菌纖維素，各組細菌纖維素產量結果見圖5，不同酵母菌株與A1共培養的細菌纖維素產量結果見圖6。

圖5 菌株A1與Y1共培養的細菌纖維素產量Fig.5 Bacterial cellulose yield by strain A1 co-culture with strain Y1

由圖5可知，細菌纖維素產量隨著菌株Y1比例的增加呈現出先增加后減小的趨勢，但均高于對照組，表明菌株Y1能夠促進菌株A1產生細菌纖維素。當菌株A1與Y1的比例為1∶100時，產生的細菌纖維素最多，為4.70 g/L，約是菌株A1純培養的3.2倍，但是少于紅茶菌產生的細菌纖維素，可能菌株Y2和Y3對A1也具有促進作用。由圖6可知，菌株Y2對菌株A1具有較強的促進作用，但不及菌株Y1，而菌株Y3對菌株A1沒有促進作用。有研究表明，在發酵過程中酵母菌產生的低濃度乙醇能夠促進醋酸菌產生細菌纖維素，除此之外，3-甲基丁醇、乙酸、乳酸、糠醛和某些氨基酸也在這個過程中起作用[20]。

圖6 不同酵母菌株與A1共培養的細菌纖維素產量Fig.6 Bacterial cellulose yield by strain A1 co-culture with different yeast strains

3 結論

通過培養的方法從紅茶菌中分離得到1株醋酸菌A1和3株酵母菌（Y1、Y2及Y3）。經分子生物學鑒定分別為居間駒形桿菌（Komagataeibacter intermedius）；布魯塞爾酒香酵母（Brettanomyces bruxellensis）、二孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）和核果梅奇酵母（Metschnikowia fruc ticola），其中B.bruxellensis為優勢酵母。將K.intermedius與B.bruxellensis以1∶100的比例共培養時產生的細菌纖維素最多，為4.70 g/L，是K.intermedius純培養的3.2倍；K.intermedius與Z.bisporus以1∶100的比例共培養時產生的細菌纖維素為3.59 g/L，是K.intermedius純培養的2.5倍；K.intermedius與M.fructicola以1∶100的比例共培養時產生的細菌纖維素與K.intermedius純培養幾乎相同。結果表明，紅茶菌中B.bruxellensis和Z.bisporus能夠促進K.intermedius產細菌纖維素，而M.fructicola對K.intermedius沒有明顯的促進作用。