56Fe17+重離子誘變選育高產(chǎn)輔酶Q10類球紅細(xì)菌

高維東，馬項(xiàng)英，彌 超，秦 云，劉 恭，謝小冬*

（1.蘭州天禾生物催化技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省特膳食品工程研究中心，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

輔酶Q10（coenzyme Q10）又名泛醌（ubiquinone），其在動(dòng)物、植物及微生物體細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，大量存在于細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)中，基本以具有抗氧化活性的還原態(tài)存在[1-3]。輔酶Q10由于在體內(nèi)直接參與代謝，無毒副作用，作為一種良好的生化藥物在臨床上被廣泛應(yīng)用于心血管疾病方面的治療[4-9]；除此之外，輔酶Q10作為一種天然抗氧化劑、細(xì)胞代謝的激活劑，具有促進(jìn)皮膚新陳代謝、減緩皺紋形成從而延緩衰老的功能，在化妝品和保健品領(lǐng)域越來越多的被應(yīng)用到[10-13]。

輔酶Q10現(xiàn)有的生產(chǎn)方法主要包括提取分離法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，其中微生物發(fā)酵法相較于提取分離法和化學(xué)合成法，生產(chǎn)的產(chǎn)品為全反式輔酶Q10，反式輔酶Q10具有還原性，有非常強(qiáng)的藥理活性，人體生物利用度高，且微生物發(fā)酵法原料廉價(jià)豐富，產(chǎn)物分離過程相對(duì)簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度高[14-18]，受到廣泛的關(guān)注。但微生物本身生產(chǎn)輔酶Q10產(chǎn)量較低，多使用誘變方法提高輔酶Q10產(chǎn)量，然而56Fe17+重離子束照射類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）誘變選育高產(chǎn)輔酶Q10突菌株技術(shù)仍屬空白[19]。

本研究采用56Fe17+重離子束照射對(duì)輔酶Q10生產(chǎn)野生型類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）進(jìn)行誘變，通過羅紅霉素、卡那霉素、疊氮鈉、對(duì)羥基苯甲酸和維生素K3五種篩選因子篩選高產(chǎn)輔酶Q10突變菌株，以期為商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)輔酶Q10尋求優(yōu)良菌株，并為相關(guān)研究提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroate）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心（China center of industrial culture collection，CICC），CICC編號(hào)為10287。

1.1.2 化學(xué)試劑

輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；濃硫酸、葡萄糖、玉米漿粉、乙醇、酵母提取物、谷氨酸鈉、磷酸二氫鉀、羅紅霉素、疊氮鈉、卡那霉素、對(duì)羥基苯甲酸、氯化鈉、碳酸鈣、鹽酸硫銨、硫酸鎂、生物素、瓊脂粉、煙酸：均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（NH1培養(yǎng)基）[20]：葡萄糖3 g/L，氯化鈉2 g/L，酵母提取物8 g/L，磷酸二氫鉀1.3 g/L，硫酸鎂0.125 g/L，鹽酸硫胺1 mg/L，生物素15 μg/L，煙酸1 mg/L，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，固體培養(yǎng)基添加2.0%瓊脂粉，115 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[20]：玉米漿干粉3 g/L，谷氨酸鈉3 g/L，氯化鈉2.8 g/L，硫酸銨3 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，葡萄糖30 g/L，硫酸鎂6.3 g/L，碳酸鈣2 g/L，鹽酸硫胺1 mg/L，生物素15 μg/L，煙酸1 mg/L，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

56Fe17+重離子束：中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所蘭州重離子加速器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；LAN-40-H/L純水儀：重慶力德高端水處理設(shè)備有限公司；AL104電子天平、FE20型pH計(jì)：梅特-托利多儀器有限公司；SHIMADZLJ型UV2450紫外可見分光光度計(jì)：日本島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；BSD-YX3600雙層恒溫?fù)u床、LRH-150F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；RE-5220高速冷凍離心機(jī)：上海試驗(yàn)儀器廠；DHG9070A（101-1）實(shí)驗(yàn)室烘箱：南京同皓干燥設(shè)備有限公司；YX-350B雙層立式蒸汽壓力滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 類球紅細(xì)菌的培養(yǎng)

菌株的活化：將保存的類球紅細(xì)菌接種于種子固體培養(yǎng)基，在30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)72 h。

種子液的制備：挑取單菌落接種于裝液量為30 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基，在30 ℃、230 r/min條件下振蕩培養(yǎng)30 h。

1.3.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取5 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的種子液，接種到裝液量為30 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 ℃、230 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。每間隔4 h取1 mL菌液，6 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，加入1 mL蒸餾水混勻。采用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值（OD600nm值），繪制其生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 發(fā)酵曲線的測(cè)定

取5 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子培養(yǎng)液于裝液量為50 mL/250mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，平行設(shè)置3組，30℃、230r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，每間隔4 h分別吸取10 mL發(fā)酵液，6 000 r/min離心10 min，棄上清液，測(cè)定輔酶Q10含量。

1.3.456Fe17+重離子束照射誘變

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的發(fā)酵液10 mL，5 000 r/min離心，棄上清，用無菌生理鹽水洗滌兩次，重新懸浮于10 mL生理鹽水中，即得菌懸液。將2 mL菌懸液裝入3 mL無菌離心管中，在56Fe17+重離子束照射劑量分別為2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、16 Gy的條件下進(jìn)行誘變處理，每個(gè)劑量重復(fù)試驗(yàn)兩次，以未誘變處理的菌懸液為空白對(duì)照。56Fe17+重離子照射誘變結(jié)束后，將菌懸液梯度稀釋，取稀釋度為10-5、10-6、10-7的菌懸液各0.2 mL涂布于種子固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[21]，并計(jì)算致死率，其計(jì)算公式如下：

1.3.5 篩選因子對(duì)類球紅細(xì)菌的最小抑制濃度測(cè)定

取0.2 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子培養(yǎng)液接種于含有篩選因子的種子固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。篩選因子及其質(zhì)量濃度分別為疊氮鈉：6 mg/L、7 mg/L、8 mg/L、9 mg/L、10 mg/L；維生素K3：5 mg/L、6 mg/L、7 mg/L、8 mg/L、9 mg/L，對(duì)羥基苯甲酸：300 mg/L、350 mg/L、400 mg/L、450 mg/L、500 mg/L，羅紅霉素：10 mg/L、20 mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L，卡那霉素：8mg/L、10mg/L、12mg/L、14 mg/L、16 mg/L，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3.6 高產(chǎn)輔酶Q10突變菌株的篩選

空白平板篩選：取最佳56Fe17+重離子束照射劑量誘變后的菌懸液0.2 mL涂布于NH1種子培養(yǎng)基，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)7 d，根據(jù)長(zhǎng)出的菌落顏色、形狀、大小等性狀的不同，挑取菌落接種于NH1種子液體培養(yǎng)基，30 ℃條件下恒溫振蕩培養(yǎng)4 d。取種子液5 mL接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量50 mL/100 mL，30 ℃、230 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定輔酶Q10的產(chǎn)量。

抗性篩選：取最佳56Fe17+重離子束照射劑量誘變后的菌懸液0.2 mL分別涂布于含有篩選因子的5種NH1種子固體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d。挑取5種篩選培養(yǎng)基上的單菌落各200株，分別接種于NH1種子液體培養(yǎng)基，30 ℃條件下恒溫振蕩培養(yǎng)4 d。取種子液5 mL接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量50 mL/100 mL，30 ℃、230 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測(cè)定輔酶Q10的產(chǎn)量。

1.3.7 高產(chǎn)輔酶Q10突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

將篩選到的高產(chǎn)輔酶Q10的突變株接種于NH1種子液體培養(yǎng)基，30 ℃、230 r/min條件下培養(yǎng)4 d。取種子液5 mL接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量50 mL/100 mL，30 ℃、230 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測(cè)定輔酶Q10的產(chǎn)量。

1.3.8 輔酶Q10含量的測(cè)定

采用皂化法[22]提取類球紅細(xì)菌中的輔酶Q10，將已破碎的菌體細(xì)胞加入7.5 mL pH值為11.0的氫氧化鈉溶液中，90 ℃恒溫加熱30 min，迅速冷卻。將已冷卻的皂化液轉(zhuǎn)移至500 mL封液漏斗，加入等體積的石油醚，充分振蕩萃取兩次，靜置分層，收集上層萃取液，最后合并兩次萃取液，轉(zhuǎn)移至真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，60 ℃蒸干石油醚，在剩余干粉中加入一定量的無水乙醇，微熱溶解，采用紫外分光光度法測(cè)定輔酶Q10含量[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 類球紅細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線

類球紅細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線見圖1。由圖1可知，在0～l0 h，類球紅細(xì)菌處于較長(zhǎng)的延滯期，培養(yǎng)基液體顏色基本無變化；15～30 h內(nèi)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體數(shù)量急速增長(zhǎng)，培養(yǎng)基液體顏色逐漸變灰綠色；30～40 h菌體處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)基液體徹底變?yōu)闈饩G色；40 h后進(jìn)入衰亡期。

圖1 類球紅細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Rhodobacter sphaeroate

2.2 類球紅細(xì)菌的發(fā)酵曲線

類球紅細(xì)菌的輔酶Q10產(chǎn)量見圖2。由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，輔酶Q10產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后緩慢下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵48 h時(shí)，輔酶Q10產(chǎn)量最高，為74.53 mg/L，因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

圖2 類球紅細(xì)菌的發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curve of Rhodobacter sphaeroate

2.3 56Fe17+重離子束照射類球紅細(xì)菌的致死率

經(jīng)56Fe17+重離子照射誘變后，類球紅細(xì)菌的致死率見圖3。由圖3可知，類球紅細(xì)菌的致死率隨著56Fe17+重離子照射劑量的增加而增大，當(dāng)照射劑量為16 Gy時(shí)，致死率達(dá)到99.7%，誘變效果最好。因此，選擇最佳照射劑量為16 Gy。

圖3 類球紅細(xì)菌的致死率曲線Fig.3 Fatality rate of Rhodobacter sphaeroate

2.4 篩選因子最小抑制濃度測(cè)定

通過測(cè)定篩選因子對(duì)類球紅細(xì)菌的最小抑制濃度發(fā)現(xiàn)，疊氮鈉對(duì)類球紅細(xì)菌的最小抑制質(zhì)量濃度為10 mg/L；維生素K3對(duì)類球紅細(xì)菌的最小抑制質(zhì)量濃度為10 mg/L；對(duì)羥基苯甲酸的最小抑制質(zhì)量濃度為450 mg/L；羅紅霉素對(duì)類球紅細(xì)菌的最小抑制質(zhì)量濃度為50 mg/L；卡那霉素的最小抑制質(zhì)量濃度為16 mg/L。因此，確定各篩選因子的最小抑制質(zhì)量濃度為該篩選因子的初始濃度。

2.5 56Fe17+重離子束照射誘變高產(chǎn)輔酶Q10菌株的篩選

2.5.1 空白平板篩選

通過空白平板篩選得到5株高產(chǎn)輔酶Q10菌株，編號(hào)為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5，其輔酶Q10產(chǎn)量見表1。由表1可知，5株菌株的輔酶Q10產(chǎn)量為76.34～96.43 mg/L，其中菌株B-5的輔酶Q10產(chǎn)量最高，達(dá)96.43 mg/L，比原始菌株提高了29.38%。

表1 空白平板篩選得到的突變株的輔酶Q10產(chǎn)量Table 1 Coenzyme Q10 yield of mutant strains screened by blank plates

2.5.2 疊氮鈉抗性篩選

通過疊氮鈉（10 mg/L）抗性平板篩選得到5株高產(chǎn)輔酶Q10菌株，編號(hào)為Sa-1、Sa-2、Sa-3、Sa-4、Sa-5，其輔酶Q10產(chǎn)量見表2。由表2可知，5株菌株的輔酶Q10產(chǎn)量為76.81～127.86 mg/L，其中菌株Sa-5的輔酶Q10產(chǎn)量最高，達(dá)127.86 mg/L，比原始菌株提高了69.73%。

表2 抗疊氮鈉突變菌株的輔酶Q10產(chǎn)量Table 2 Coenzyme Q10 yield of mutant strains with sodium azide resistance

2.5.3 維生素K3抗性篩選

通過維生素K3（9 mg/L）抗性平板篩選得到5株高產(chǎn)輔酶Q10菌株，編號(hào)為V-1、V-2、V-3、V-4、V-5，其產(chǎn)量見表3。由表3可知，5株菌株的輔酶Q10產(chǎn)量為75.30～91.03 mg/L，其中，菌株V-1輔酶Q10產(chǎn)量最高，達(dá)91.03 mg/L，比原始菌株提高了23.36%。

表3 抗維生素K3突變株的輔酶Q10產(chǎn)量Table 3 Coenzyme Q10 yield of mutant strains with vitamin K3 resistance

2.5.4 卡那霉素抗性篩選

通過卡那霉素（16 mg/L）抗性平板篩選得到5株高產(chǎn)輔酶Q10菌株，編號(hào)為K-1、K-2、K-3、K-4、K-5，其產(chǎn)量見表4。由表4可知，5株菌株的輔酶Q10產(chǎn)量為78.33～97.15 mg/L，其中菌株K-2輔酶Q10產(chǎn)量最高，達(dá)97.15 mg/L，比原始菌株提高了24.03%。

2.5.5 羅紅霉素抗性篩選

通過羅紅霉素（30 mg/L）抗性平板篩選得到5株高產(chǎn)輔酶Q10的菌株，編號(hào)為R-1、R-2、R-3、R-4、R-5，其產(chǎn)量見表5。由表5可知，5株菌株的輔酶Q10產(chǎn)量為73.56～85.48 mg/L，其中菌株R-2的輔酶Q10產(chǎn)量最高，達(dá)85.48 mg/L，比原始菌株提高了16.20%。

表5 抗羅紅霉素突變株的輔酶Q10產(chǎn)量Table 5 Coenzyme Q10 yield of mutant strains with roxithromycin resistance

綜上，通過56Fe17+重離子束照射誘變類球紅細(xì)菌并結(jié)合抗性因子篩選，得到1株高產(chǎn)輔酶Q10的菌株Sa-5，其輔酶Q10產(chǎn)量最高，達(dá)127.86 mg/L，比原始菌株提高了69.73%。

2.6 突變菌株Sa-5的遺傳穩(wěn)定性

將突變菌株Sa-5在斜面上連續(xù)傳5代，每代的輔酶Q10產(chǎn)量見圖4。由圖4可知，突變菌株Sa-5的輔酶Q10產(chǎn)量隨傳代次數(shù)的增加變化幅度較小，輔酶Q10產(chǎn)量為126～129.1mg/L。說明突變菌株Sa-5是一株高產(chǎn)輔酶Q10且遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良菌株。

圖4 突變菌株Sa-5的遺傳穩(wěn)定性Fig.4 Genetic stability of mutant strain Sa-5

3 結(jié)論

通過照射劑量為16 Gy的56Fe17+重離子束對(duì)類球紅細(xì)菌進(jìn)行誘變后，采用疊氮鈉抗性篩選得到1株高產(chǎn)輔酶Q10的菌株Sa-5，其輔酶Q10產(chǎn)量達(dá)127.86 mg/L，比原始菌株提高了69.73%，是一株高產(chǎn)輔酶Q10且遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良菌株。