深低溫冷凍保存同種異體前交叉韌帶移植免疫研究*

張 培 劉 泉 周建生 朱 坤 趙 皓 項 平

1 蚌埠醫學院第一附屬醫院骨科,安徽省蚌埠市 233000; 2 組織移植安徽省重點實驗室

關節鏡下交叉韌帶重建是目前臨床治療交叉韌帶損傷常用的方法[1]，移植物的選擇臨床各異。同種異體前交叉韌帶(Anterior cruciate ligament，ACL)移植重建因免疫排斥反應破壞了移植體的結構，影響移植的療效，術后如何更好地抑制免疫排斥反應仍是大家研究的課題。既往研究有相關方面報道[2]，然而異體韌帶移植后局部和全身反應的機理報道較少，本課題從受體對移植物的免疫排斥反應方面入手，采用深低溫冷凍保存同種異體大鼠ACL修復ACL損傷，對比分析局部與全身免疫的差異和水平，探索同種異體交叉韌帶移植后宿主對移植物的免疫反應情況，進而為異體交叉韌帶移植后指導免疫抑制劑的合理應用，提高臨床療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠60只，鼠齡6～8周，體質量250～300g，由蚌埠醫學院實驗動物中心提供，通過蚌埠醫學院第一附屬醫院動物倫理委員會批準，實驗過程中對動物處置嚴格遵守國家科學技術部2006年《關于善待實驗動物的指導性意見》的要求。動物傳染病檢查雙后肢、膝關節X線骨科檢查正常。

1.2 動物分組 從60只大鼠中按照隨機數字表方法隨機選擇15只大鼠，切取30個后肢ACL標本，再將30個ACL標本按隨機數字表方法隨機分為冷凍保存組和常溫保存組，每組15個。余45只大鼠采用隨機數字表方法分三組，每組15只：A組采用正常自體移植物， B組采用冷凍保存的同種異體移植物，C組采用非冷凍保存異體組織移植物。

1.3 實驗方法

1.3.1 ACL的切取與保存。動物術前禁食、禁水8h，術前30min予阿托品0.5mg/kg肌注，采用3%戊巴比妥鈉1ml/kg行腹腔注射麻醉。麻醉生效后固定于手術臺上，手術嚴格按無菌要求操作，后肢雙側全膝關節剃毛，常規消毒、鋪巾。15只大鼠雙膝關節外側縱形切口，切開關節囊，將髕骨向內側脫位，顯露并切取ACL。切取的30個ACL隨機分為冷凍保存組和常溫保存組。冷凍保存組15個標本經D-hank’s液漂洗后放入盛有1.5ml冷凍保護液(二甲基亞砜10%，DMEM 40%，小牛血清50%)的凍存管中，在4℃冰箱中平衡30min，移入-40℃冰箱，以0.5～1℃/min速度降至-40℃，維持2h，再投入-196℃液氮中保存2周。其余15個標本常溫保存。

1.3.2 ACL的移植重建。ACL的切除：45只大鼠取右側后肢膝關節外側長約1.0cm的縱切口，關節囊外側打開，使髕骨內側脫位。在ACL止點處切除ACL，檢查前抽屜試驗及Lachman試驗陽性，術時注意保護關節面、關節軟骨、后交叉韌帶及髕下脂肪墊。

ACL的移植重建：大鼠右側后肢膝關節屈曲100°，進行ACL的移植。A組：將切取的ACL再次植入，制作正常自體ACL移植重建模型。B組：將冷凍保存組的ACL凍存管置37℃水浴箱1min內快速復溫解融，取出ACL用D-hank’s液漂洗3次，清除低溫保護劑。然后將ACL移植，制作冷凍保存同種異體移植組動物模型。C組：將常溫保存異體ACL植入，制作非冷凍保存異體組織移植。移植韌帶兩端用0號絲線縫合固定，檢查重建韌帶位置良好后，同時檢查前抽屜試驗及Lachman試驗陰性，以數碼相機拍攝移植后移植韌帶情況。關節內稀碘伏沖洗后再用大量生理鹽水沖洗膝關節腔及傷口，縫合傷口，包扎。

1.3.3 術后處理。45只大鼠術后肌注1次青霉素(4×107U/L)1ml抗感染，待SD大鼠清醒后曲馬多(10mg/kg)止痛，分籠飼養，傷口消毒換藥，自由進食水。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般情況：觀察術后動物精神狀態、飲食及傷口愈合情況。

1.4.2 細胞免疫因子水平測定：在術后12、24、48h，每組隨機選擇5只大鼠，麻醉成功后抽取血液及手術側的關節液，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定關節局部組織液與血清中TNF-α、IL-2、IL-6水平。同時采用瑞氏染液染色，顯微鏡下觀察記錄關節局部組織液與血清中吞噬細胞功能檢測，計數測定不同時間點吞噬細胞的吞噬率和吞噬指數變化[3]。吞噬率(%)=(吞噬有細菌的吞噬細胞數)/(計數的100個吞噬細胞)×100%，吞噬指數=100個吞噬細胞所吞噬的細菌總數/計數的100個吞噬細胞。

1.4.3 組織學觀察：處死動物，取出移植韌帶，在顯微鏡下觀察韌帶色澤、彈性、滑膜包裹和血管浸潤情況，以及關節軟骨、半月板等結構退變情況。

2 結果

2.1 一般情況 術后0.5～1h，所有大鼠蘇醒，實驗動物均能夠自由覓食，體質量變化比較差異無顯著性(P>0.05)。A、B組傷口均愈合良好，C組5例出現傷口紅腫，2例有少量感染滲出，均經過換藥處理后愈合，實驗大鼠均無死亡。

2.2 大體及顯微組織學觀察 在每個觀察節點，A、B組移植韌帶光澤明亮，周圍出現極少量的未侵入組織內的淋巴細胞，未發現組織壞死狀況，移植韌帶結構清晰，膠原排列有序，彈性良好。C組移植韌帶光澤相對較暗，韌帶表面絮狀物附著，炎性細胞浸潤，韌帶彈性相對A、B組差。

2.3 細胞免疫因子測定

2.3.1 實驗動物血清TNF-α水平比較：在術后的每個觀察時間點，A組、B組TNF-α水平基本相同，差異無顯著性(P>0.05)，而每個觀察時間點，A組、B組TNF-α水平明顯高于C組(P<0.01)，見表1。實驗動物關節液中TNF-α水平比較：在術后的每個觀察時間點，A組、B組TNF-α水平基本相同，差異無顯著性(P>0.05)，而每個觀察時間點，A組、B組TNF-α水平明顯高于C組(術后12h時P<0.05，術后24h、48h時P<0.01)。在縱向比較發現，關節局部組織液中TNF-α水平增幅明顯高于血清中(P<0.01)。

表1 術后不同時間點各組大鼠血清、關節液TNF-α水平比較

注： A組、B組與同時間點C組比較，aP<0.05，bP<0.01。

2.3.2 實驗動物血清IL-2、IL-6水平比較：在術后每個觀察時間點，A組、B組IL-2、IL-6水平基本相同，差異無顯著性(P>0.05)，而每個觀察時間點，A組、B組IL-2、IL-6水平明顯高于C組(P<0.01)，見表2。

2.3.3 實驗動物關節液吞噬細胞吞噬率、吞噬指數比較：在術后每個觀察時間點，A組、B組吞噬細胞吞噬率、吞噬指數基本相同，差異無顯著性(P>0.05)，而每個觀察時間點，A組、B組吞噬細胞吞噬率、吞噬指數明顯高于C組(P<0．01)，見表3。

表2 術后不同時間點各組大鼠血清IL-2、IL-6水平比較

注：A組、B組與同時間點C組比較，aP<0.01。

表3 術后不同時間點各組大鼠關節液吞噬細胞吞噬率、吞噬指數

注：A組、B組與同時間點C組比較，aP<0.01。

3 討論

前交叉韌帶是膝關節重要的穩定結構，可以防止膝關節過伸、限制脛骨前移、控制脛骨旋轉和維持股骨與脛骨穩定的對應關系，當ACL損傷時一般難以自行修復[2]，可引起不同程度的膝關節不穩及功能受限，如不及時處理將繼發膝關節半月板退行性變，引起創傷性關節炎的發生[4]。

移植物的安全是前交叉韌帶重建成功的關鍵環節[5-6]，交叉韌帶重建以自體組織移植的效果較理想[7]，但其會出現供區損傷等并發癥，同時存在翻修術時移植物來源缺乏問題，因而常常無法滿足臨床需求。近年來同種異體交叉韌帶重建有所發展，并且是自體組織良好的替代物[8]，而移植后的免疫排斥反應則會嚴重影響移植效果，因而如何降低并監測異體移植物的免疫原性，抑制移植后排斥成為異體移植物重建前交叉韌帶成功的關鍵[9]，一般來說，為避免移植排斥反應常采用深低溫冷凍處理移植物來消除抗原[10]，同時可以在術后應用免疫抑制劑，由此在臨床上就需要考慮到如何應用抑制劑及其劑量的調整、使用時間和應用的效果的判斷。本實驗研究發現，在術后每個時間的觀察點，A組、B組移植物大體觀察相似，TNF-α、IL-2水平比較無差異(P>0．05)，C組低于A組、B組，差異有明顯的顯著性(P<0．05)，IL-2的主要生物學功能是促進T細胞的增殖與分化，這說明深低溫處理的異種移植物T細胞介導免疫反應明顯減弱，T 細胞活化明顯降低，表明引起較微弱的細胞免疫反應，具有較小的免疫原性，所以引發的排斥反應十分微弱，破壞性小，而未經冷凍處理的移植物有明顯的抗原性，與既往學者研究結果相同[11]，本實驗中IL-2和TNF-α均同時得到增長，說明在免疫調節方面發揮著協同增效作用。IL-6是通過激活效應細胞或繼發性釋放其他細胞因子來直接或間接地實現免疫效應，本實驗中IL-2與IL-6出現同步升高，一定程度上說明在免疫應答中起到相互協同作用。

新鮮異體移植物的免疫反應強烈，經冷凍處理可滅活、破壞活細胞，降解移植物供體細胞表面的抗原結構，從而減輕免疫反應。吞噬細胞包括外周血中的中性粒細胞和單核細胞以及多種器官、組織中的巨噬細胞，在免疫應答、效應及調節過程中起重要作用。本實驗結果顯示，C組吞噬細胞吞噬率和吞噬指數明顯低于A組、B組，表明C組免疫細胞因子的水平明顯降低，更加抑制機體體液免疫反應。A組、B組比較差異無顯著性，表明深低溫處理后可以有效預防細胞免疫因子的抑制，同時A組、B組植入物周邊僅存在少量淋巴細胞浸潤，未發現組織壞死現象。而C組移植物遭到破壞，局部淋巴細胞浸潤明顯，引起免疫排斥反應，由此冷凍處理可以明顯改變肌腱細胞表面的抗原性，同時局部免疫較全身免疫反應較快，說明局部的免疫指標可以更好地反應關節的炎癥反應，進而指導臨床用藥。

異體移植物的轉歸對于ACL重建后的生物學功能有著重要的作用，因ACL的轉歸是影響移植物轉歸的重要因素，移植物的轉歸受諸多因素的影響，諸如骨隧道內不同填充物的介入[12]、不適當的康復計劃[13]、手術時機的選擇[14]，另外解剖重建與等長重建[15]、交叉韌帶殘端的保留情況[16]，由此促進移植物的轉歸研究各異，同種異體移植物的處理方法、移植的手術方法、來源等是影響移植物轉歸主要原因[17]。經過冷凍處理的同種異體移植韌帶可以避免供區疼痛、感染等并發癥，相對自體肌腱移植患者疼痛以及關節僵硬概率更小，所以冷凍處理同種異體肌腱移植為大多數術者及患者接受[18]，本實驗采用兩步冷凍保存同種異體ACL重建，對比研究證實深低溫冷凍保存能夠很好地清除異體ACL表面抗原，最大限度減輕免疫排斥反應，促進移植物的轉歸，這與既往學者研究結果相同[19]。

綜上所述，深低溫冷凍保存能夠很好地減輕免疫排斥反應，其局部較全身的免疫排斥反應相對較明顯，進而為臨床更早、更有效地觀察移植后免疫排斥情況開辟新的途徑，更有利于免疫抑制劑的合理應用，然而細菌、病毒可能是潛在的傳染源[20]，并且遠期反應尚需要進一步研究。