miR-199a-3p在卵巢癌組織中的表達(dá)及其對癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的影響

宋洋，任芳

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽117004

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，致死率居婦科腫瘤之首[1]。該病早期無明顯癥狀，多數(shù)患者在確診時已是癌癥晚期[2]。miRNA是一類平均長度約22個堿基的單鏈非編碼小RNA分子，在真核細(xì)胞中廣泛存在。miRNA通過部分或完全結(jié)合靶基因信使RNA的3′非編碼區(qū)堿基進(jìn)而發(fā)揮負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)的作用[3]。大量研究表明，miRNA不僅參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等正常生理過程，還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌組織中miR-199a-3p表達(dá)降低，可能具有抑癌作用，然而其作用機(jī)制仍不清楚[6]。2018年11月～2019年7月，本研究對miR-199a-3p在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)及對癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移影響的可能機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3、OV-90、CAOV3、HO-8910S購自上海中喬新舟生物科技有限公司，OVCAR3細(xì)胞購自北京北納生物科技有限公司；其中SK-OV-3細(xì)胞和HO-8910細(xì)胞培養(yǎng)于PRMI-1640培養(yǎng)液中(含15%胎牛血清)，OV-90細(xì)胞和CAOV3細(xì)胞培養(yǎng)于42.5%MCDB105(含1.5 g/L碳酸氫鈉)+42.5%M199(含2.2 g/L碳酸氫鈉)培養(yǎng)基中(含15%胎牛血清)；培養(yǎng)基以及胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司。CCK-8檢測試劑購自日本同仁公司；NC mimic和miR-199a-3p mimic由上海吉瑪基因合成；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；TRLzol試劑以及TIANSeq M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自百泰克生物技術(shù)有限公司；SYBR Green qPCR Mix購自TOYOBO公司；pMIR-reporter熒光素酶載體購自美國Ambion公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 細(xì)胞miR-199a-3p表達(dá)檢測 采用TRLzol試劑提取組織和細(xì)胞的總RNA，并通過TIANSeq M-MLV反轉(zhuǎn)錄成cDNA，試驗步驟參照試劑說明進(jìn)行操作。采用SYBR Green qPCR Mix進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，熒光定量總反應(yīng)體系為20 μL，其中含有cDNA模板2 μL，SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，加雙蒸水至20 μL。試驗中所用引物序列如下：smad1，上游引物：5′- AACCGTTTGAAGTGTAA-3′，下游引物：5′-5′-AAACAAACTGGGAAAGA-3′；β-actin，上游引物：5′-CGCCCCAGGCACCAGGGC-3′，下游引物：5′-GCTGGGGTGTTGAAGGT-3′。采用2-△△Ct法計算細(xì)胞株miR-199a-3p相對表達(dá)量。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取適量細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長至70%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。同株細(xì)胞分為三組：對照組、NC mimic轉(zhuǎn)染組、miR-199a-3p mimic組。對照組不加任何試劑，miR-199a-3p mimic組、NC mimic轉(zhuǎn)染組分別加入miR-199a-3p mimic和NC mimic轉(zhuǎn)染試劑，試驗步驟按試劑說明進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測 采用MTT法。按照每孔3×103個的密度將細(xì)胞接種至96孔板。于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h時向每孔加入MTT試劑(20 μL，5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液150 μL， 10 min后在酶標(biāo)儀上測量570 nm處的吸光度值。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測 采用Transwell小室試驗檢測卵巢癌細(xì)胞的遷移能力。轉(zhuǎn)染48 h后，取對數(shù)期生長的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸后，取適量細(xì)胞加入上室，下室加入700 μL 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后取出。上室的細(xì)胞用棉簽處理干凈，轉(zhuǎn)移到下室的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.25%結(jié)晶紫染色，最后于顯微鏡下拍照記錄計數(shù)細(xì)胞。

1.6 卵巢癌細(xì)胞中miR-199a-3p對smad1調(diào)控作用檢測 將含有smad1能夠被miR-199a-3p識別的野生型序列(5′-ACCTCTGTGACCAAC TATTG-3′)的質(zhì)粒wt-smad1和含有smad1突變型序列(5′- ACCTCTGTGACCATAATTTG -3′)的質(zhì)粒mut-smad1分別與miR-199a-3p mimic或NC mimic共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染24 h后采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測各組的熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 miR-199a-3p 在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá) 人卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3、CAOV3、HO-8910S、OV-90的miR-199a-3p的相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.80±0.11、3.00±0.31、0.32±0.04。顯示miR-199a-3p在CaOV3和OV-90卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)水平低于其他細(xì)胞(P均<0.05)。因此選擇這兩株細(xì)胞用于后續(xù)過表達(dá)miR-199a-3p的研究。

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-199a-3p表達(dá) miR-199a-3p mimic轉(zhuǎn)染至CaOV3和OV-90卵巢癌細(xì)胞后，CaOV3卵巢癌細(xì)胞對照組、NC mimic轉(zhuǎn)染組、miR-199a-3p mimic組miR-199a-3p表達(dá)分別為1.00±0.00、1.03±0.16、3.17±0.35。OV-90卵巢癌細(xì)胞對照組、NC mimic轉(zhuǎn)染組、miR-199a-3p mimic組miR-199a-3p表達(dá)分別為1.00±0.00、1.06±0.13、3.25±0.38。顯示miR-199a-3p mimic組miR-199a-3p表達(dá)較對照組、NC mimic轉(zhuǎn)染組升高(P均<0.05)。

2.3 miR-199a-3p過表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，CAOV3細(xì)胞、OV-90細(xì)胞miR-199a-3p mimic組較對照組、NC mimic轉(zhuǎn)染組在相同時間點增殖能力降低(P均<0.05)，見表1、表2。

表1 過表達(dá)miR-199a-3p對CAOV3細(xì)胞增殖能力的影響

注：與對照組、NC mimic轉(zhuǎn)染組比較，*P<0.05。

表2 過表達(dá)miR-199a-3p對OV-90細(xì)胞增殖能力的影響

注：與對照組、NC mimic轉(zhuǎn)染組比較，*P<0.05。

2.4 過表達(dá)miR-199a-3p對卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 Transwell試驗結(jié)果顯示，CaOV3卵巢癌對照組、NC mimic轉(zhuǎn)染組、miR-199a-3p mimic組細(xì)胞遷移數(shù)量分別為(63.4±6.91)、(64.2±5.54)、(28.7±3.21)個。OV-90卵巢癌細(xì)胞對照組、NC mimic轉(zhuǎn)染組、miR-199a-3p mimic組細(xì)胞遷移數(shù)量分別為(66.2±6.02)、(66.5±4.65)、(31.9±3.63)個。兩株細(xì)胞中，miR-199a-3p mimic組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力均低于對照組(P均<0.05)。

2.5 卵巢癌細(xì)胞中miR-199a-3p對smad1的調(diào)控作用 雙熒光素酶報告試驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染wt-smad1 3′UTR質(zhì)粒和NC mimc 的細(xì)胞熒光素酶強度為0.722±0.094，共轉(zhuǎn)染 wt-smad1 3′UTR質(zhì)粒和miR-199a-3p mimic的細(xì)胞熒光素酶強度為0.285±0.042，共轉(zhuǎn)染mut-smad1 3′UTR質(zhì)粒和NC mimic的細(xì)胞熒光素酶強度為0.684±0.083，共轉(zhuǎn)染mut-smad1 3′UTR質(zhì)粒和miR-199a-3p mimic的細(xì)胞熒光素酶強度為0.679±0.087。與其他細(xì)胞比較，wt-smad1 3′UTR+ miR-199a-3p mimic細(xì)胞中相對熒光素酶活性降低(P均<0.05)；wt-smad1 3′UTR+NC mimic的細(xì)胞和mut-smad1 3′UTR+miR-199a-3p mimic的細(xì)胞中熒光素酶的活性均未發(fā)生變化。提示miR-199a-3p能夠靶向結(jié)合smad1的3′UTR區(qū)進(jìn)而調(diào)控其表達(dá)。

3 討論

大量研究證實，miRNA在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，miRNA的異常表達(dá)常具有作為腫瘤標(biāo)記物及治療靶點的潛力[7,8]。研究證實，在卵巢癌中有包含miR-199a在內(nèi)的25種miRNAs下調(diào)，提示miR-199a-3p的異常表達(dá)可能與卵巢癌不良預(yù)后相關(guān)[9]。

miRNA的功能主要是通過調(diào)控下游靶基因?qū)崿F(xiàn)的，同一個miRNA能夠靶向調(diào)控多個目的基因從而發(fā)揮類似致癌基因或抑癌基因的作用[10,11]。大量研究表明，miR-199a-3p在多數(shù)腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，在骨肉瘤細(xì)胞中上調(diào)miR-199a-3p的表達(dá)能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，臨床上低表達(dá)miR-199a-3p與骨肉瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[12]。Ren等[13]在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-199a-3p能夠顯著抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制與調(diào)控YAP1基因有關(guān)。類似地，miR-199a-3p在腎癌組織中表達(dá)下降，過表達(dá)miR-199a-3p對腎癌細(xì)胞系的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移均有負(fù)向調(diào)控作用[14]。Phatak 等[15]報道m(xù)iR-199a-3p在食道癌組織和食道癌細(xì)胞中表達(dá)下降，過表達(dá)miR-199a-3p抑制食道癌細(xì)胞的增殖，其作用可能通過靶向調(diào)控PAK4基因?qū)崿F(xiàn)的。本研究進(jìn)一步證實將miR-199a-3p mimic轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞后，顯示過表達(dá) miR-199a-3p的卵巢癌細(xì)胞其增殖和轉(zhuǎn)移能力都明顯降低，此結(jié)果與既往研究結(jié)論一致[16,17]，即miR-199a-3p能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮類似抑癌基因的作用。

由于miRNA的功能主要是通過調(diào)控下游靶基因?qū)崿F(xiàn)的，我們進(jìn)一步探討在卵巢癌細(xì)胞中miR-199a-3p可能調(diào)控的下游靶基因。經(jīng)生物學(xué)軟件分析，miR-199a-3p的種子序列與smad1的3′UTR區(qū)互補結(jié)合。 經(jīng)雙熒光素酶試驗進(jìn)一步顯示，轉(zhuǎn)染了野生型smad1 3′UTR載體和miR-199a-3p mimic的細(xì)胞組雙熒光素酶活性明顯低于轉(zhuǎn)染了突變型smad1 3′UTR的細(xì)胞組，表明smad1是miR-199a-3p的直接作用靶點。Smad1是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子， 對機(jī)體免疫系統(tǒng)、組織胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長分化等正常生理進(jìn)程以及對腫瘤發(fā)生發(fā)展有重要作用；如smad1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，且與腫瘤上皮細(xì)胞間質(zhì)化有關(guān)[18～20]。本研究結(jié)果提示，miR-199a-3p可能通過作用smad1基因表達(dá)來發(fā)揮抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。

綜上， miR-199a-3p的表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-199a-3p在卵巢癌組織中表達(dá)下降，miR-199a-3p過表達(dá)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，且可能通過調(diào)控smad1的表達(dá)而實現(xiàn)。