胃癌組織中LncRNA HCG11、miR-144-3p的表達及臨床意義

唐澍，徐明，陳芬

郴州市第一人民醫院，湖南郴州 423000

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤[1]，患者早期常無典型臨床表現，明確診斷時已為晚期或遠處轉移，即使予以手術、化療等綜合治療，長期生存情況仍較差[2]。因而進一步探索胃癌的病因及發生機制，對于尋找新的診斷和治療靶點具有重要的臨床意義。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是細胞內長度大于200 nt的非編碼RNA分子，通過對靶基因的表觀遺傳學修飾或與其他非編碼RNA分子相互作用，在轉錄及轉錄后水平對基因表達進行調控，影響細胞的增殖、分化及衰老等病理生理學過程[3]。近年來研究發現，LncRNA HLA復合體11(HCG11)在前列腺癌、乳腺癌及結直腸癌等多種腫瘤中均存在異常表達升高或降低的現象，通過影響下游靶基因的表達，影響腫瘤的發生發展，有助于判斷患者生存預后情況[4,5]。微小RNA(miRNA)可參與構成RNA誘導的沉默復合物，通過結合信使RNA的3′非編碼區，調控靶基因翻譯，影響基因的表達。miRNA的異常表達與癌癥進展有關。據報道，作為腫瘤抑制基因的miR-144-3p在肝細胞癌、肺癌等許多癌癥中表達降低[6，7]，而miR-144-3p的過表達促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[8]。因此，miR-144-3p的功能與腫瘤類型有關。本研究通過研究胃癌癌組織中LncRNA HCG11及miR-144-3p的表達，初步探討兩者在胃癌發生發展中的機制及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年1～10月本院收治胃癌患者102例，男58例、女44例，年齡23～72(58.4±7.5)歲；合并淋巴結轉移42例，無淋巴結轉移60例；腫瘤直徑：<5 cm者57例，≥5 cm者45例；腫瘤位置：賁門部及胃底部者22例，胃體部者21例，幽門部及胃竇部者59例；腫瘤TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期84例，Ⅲ～Ⅳ期18例；組織學分化：高分化30例，中分化35例，低分化37例。納入標準：①兩位病理科醫師共同閱片，由病理學檢查確診為胃腺癌；②初診患者，未行治療；③臨床及病理學資料及隨訪資料齊全。排除標準：① 既往有其他惡性腫瘤史；②伴有重度心肺等臟器功能障礙；③合并肺炎、泌尿系統感染等急性感染性疾病。患者自術后第1天開始隨訪，每3個月隨訪1次，均隨訪3年，以門診復查的方式進行隨訪，內容主要是患者生存情況，隨訪截止至隨訪時間結束或患者出現死亡。

1.2 LncRNA HCG11、miR-144-3p表達水平檢測 應用qRT-PCR法 。取癌組織及癌旁正常組織各約100 mg，剪碎后放入研缽中加入1 mL Trizol并研磨，10 000 r/min離心5 min后去除細胞碎片。取上清用Trizol法提取組織中總RNA，然后以總RNA作為模板，按照SYBR Green反轉錄試劑盒及TaqMan microRNA反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA，分光光度計檢測cDNA濃度及純度。OD260/OD280在1.8～2.1之間，-20 ℃保存。反應條件：16 ℃ 30 min，40 ℃ 30 min，84 ℃ 5 min。2×SYBR Green PCR Master Mix試劑盒檢測LncRNA HCG11、miR-144-3p的表達。LncRNA HCG11正向引物序列5′-GCTCTATGCCATCCTGCTT-3′，下游引物序列：5′-TCCCATCTCCATCAACCC-3′，miR-144-3p上游引物序列5′-ACACTCCAGCTGGGTACAGTATAGATGATGTACT-3′，下游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′，內參基因GAPDH上游引物序列5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′，下游引物序列:5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′。總反應體系：2×Master Mix 10 μL，上游引物和下游引物分別0.5 μL，cDNA 1 μL,8 μL無RNA酶水。LncRNA HCG11qPCR反應條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環。miR-144-3p qPCR反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，50個循環。LncRNA HCG11、miR-144-3p的相對量采用2-ΔΔCt值法表示，ΔΔCt=CtLncRNA HCG11/miR-144-3p-CtGAPDH。

2 結果

2.1 癌組織和癌旁組織LncRNA HCG11、miR-144-3p表達 癌組織和癌旁組織LncRNA HCG11相對表達量分別為8.343±1.145、3.019±0.772，miR-144-3p相對表達量分別為0.431±0.102、0.957±0.163。癌組織LncRNA HCG11相對表達量高于癌旁組織(t=38.937，P<0.05)，miR-144-3p相對表達量低于癌旁組織(t=27.628，P<0.05)。

2.2 胃癌組織LncRNA HCG11、miR-144-3p表達與患者臨床病理參數的關系 癌組織LncRNA HCG11、miR-144-3p表達與腫瘤TNM分期及組織學分化有關；TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化胃癌組織LncRNA HCG11表達分別高于Ⅰ～Ⅱ期、高中分化癌組織(P均<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期、低分化癌組織miR-144-3p分別低于Ⅰ～Ⅱ期、高中分化癌組織(P均<0.05)。癌組織LncRNA HCG11、miR-144-3p表達與性別、年齡、腫瘤直徑、位置及淋巴結轉移無關(P均 >0.05)。見表1。

表1 癌組織LncRNA HCG11、miR-144-3p表達與臨床病理特征之間的關系

2.3 胃癌組織LncRNA HCG11與miR-144-3p表達的相關性 Pearson線性相關分析結果表明，胃癌癌組織中LncRNA HCG11相對表達量與miR-144-3p的相對表達量呈負相關(r=-0.611，P<0.05)。

2.4 癌組織不同LncRNA HCG11與miR-144-3p表達患者生存預后差異 102例患者隨訪2.1～48.0個月，平均隨訪時間為31.6個月，隨訪期間死亡55例。以癌組織中LncRNA HCG11及miR-144-3p的相對表達量8.343、0.431為臨界值，分為高表達組和低表達組。高LncRNA HCG11表達組3年總體生存率(OS)為36.5%(19/52)，低LncRNA HCG11表達組3年OS為56.0%(28/50)，高LncRNA HCG11表達組3年OS降低(χ2=3.886，P=0.048)。高miR-144-3p表達組3年OS為58.5%(31/53)，低miR-144-3p表達組3年OS為32.7%(16/49)，高miR-144-3p表達組3年OS升高(χ2=6.841，P=0.009)。

3 討論

胃癌是全球范圍內第2大導致癌癥死亡的惡性腫瘤[9]，常見的危險因素包括幽門螺桿菌感染、年齡、性別、吸煙史和家族史等，但目前其確切發生機制尚不明了。非編碼RNA是在真核生物中廣泛表達的一類不具有蛋白質編碼功能的RNA，根據大小可分為短ncRNA(包括小干擾RNA、miRNA)、中型ncRNA、LncRNA 3種類型。過去大多數ncRNA被認為是“垃圾RNA”。但近年來分子生物學研究發現，ncRNA在發育、分化、代謝及衰老等過程中均起重要的生物學作用[10]。ncRNA的突變或異常表達在炎癥、免疫及腫瘤等多種疾病的發生和發展中均發揮重要的調節作用。研究表明，LncRNA HCG11，通過表觀遺傳學調控靶基因的表達，影響腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移等生物學行為，并有助于判斷患者生存預后[11]。而miR-144-3p亦能夠通過調控細胞周期相關靶基因的表達，如富含脯氨酸的蛋白質11，影響腫瘤的增殖和凋亡過程[12]。ncRNA之間存在相互調控的復雜網絡，影響細胞內信號傳導，影響腫瘤的發生發展，如LncRNA HCG11能夠結合miR-543，影響雷帕霉素靶蛋白信號通路的傳導，調控腫瘤細胞的惡性生物學行為[13]。

本研究中，胃癌組織中LncRNA HCG11的相對表達量高于癌旁正常組織。可能與促進LncRNA HCG11基因表達的轉錄因子如c-myc表達增多有關[11，14]，c-myc結合于LncRNA HCG11基因啟動子區域，促進基因表達。此外，Ⅲ～Ⅳ期、低分化癌組織LncRNA HCG11表達明顯較高，表明癌組織中LncRNA HCG11表達參與腫瘤的發生發展過程。其機制可能是LncRNA HCG11能夠和胰島素樣生長因子信使RNA與結合蛋白1結合后，加速ERK、JNK和p38等因子的磷酸化，促進腫瘤細胞的增殖及惡性進展，導致腫瘤分期分級升高；而敲低其表達后細胞增殖和遷移能力降低，誘導細胞凋亡的發生[15]。本研究進一步分析高表達LncRNA HCG11對胃癌患者預后的影響，結果顯示高表達LncRNA HCG11患者3年總體生存率明顯較低，表明LncRNA HCG11有可能成為預測患者生存預后的標志物。本研究中，胃癌組織中miR-144-3p的相對表達量顯著低于癌旁組織。其機制可能與miR-144-3p表觀遺傳學修飾后表達沉默有關。有研究表明，miR-144-3p啟動子區域高甲基化時，miR-144-3p表達水平降低[16]。此外，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化的胃癌組織中miR-144-3p表達明顯較低，表明癌組織中miR-144-3p的表達亦參與腫瘤的進展。其機制可能是miR-144-3p通過結合到絲裂原激活的蛋白激酶6(MAPK6)的信使RNA的3′非編碼區，抑制MAPK6的表達，發揮抑制細胞增殖的作用；而腫瘤發生時miR-144-3p表達降低，其抑癌功能喪失，導致腫瘤細胞無限增殖及惡性進展[17]。此外，miR-144-3p尚能通過抑制PBX 同源盒3的表達，抑制腫瘤上皮轉化的發生，miR-144-3p表達降低后促進腫瘤的惡性增殖、遷移等[18]。本研究顯示，胃癌組織中LncRNA HCG11與miR-144-3p表達呈顯著負相關，可能是LncRNA HCG11能夠作為內源競爭性RNA結合并抑制miR-144-3p表達，下游癌基因表達上調，導致miR-144-3p抑癌功能降低[19]。

綜上所述，胃癌中LncRNA HCG11表達升高，而miR-144-3p表達降低，兩者均與腫瘤分期及組織學分化有關，共同參與胃癌的發生發展過程。二者有可能成為新的胃癌診斷、治療及預后評估的腫瘤標志物。