miR-3162-3p對卵清蛋白致敏小鼠肺部炎癥反應的影響及機制

馮海燕,張星亮，2,黃宇戈

1廣東醫科大學附屬醫院，廣東湛江 524001；2深圳市兒童醫院

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，臨床特點為反復發作性喘息、胸悶、咳嗽等癥狀[1]。目前，醫學界認為Treg和Th亞群免疫細胞失衡以及炎癥因子過度產生是哮喘發病機制之一，臨床上多采用糖皮質激素抗炎治療并取得了良好效果。但是哮喘發病仍未有效控制，且激素治療帶來的不良反應對患者影響較大[2～4]。miRNA是一類內源性的非編碼RNA，在特定的組織、發育階段或疾病發生的某個時期進行表達，調控轉錄后蛋白翻譯水平。研究表明，諸多疾病相關miRNAs在患者血液中的表達發生明顯變化[5, 6]，miRNA介導的相關信號通路在哮喘發生發展過程中對氣道炎癥有重要作用[7, 8]。本課題組前期報道了血液中miR-3162-3p在區分哮喘兒童和正常兒童上具有很好的靈敏性和特異性[9]。miR-3162-3p靶向下調β-catenin、miR-3162-3 p抑制劑能抑制卵清蛋白(OVA)哮喘小鼠肺內源性miR-3162-3p，減緩氣道高反應，改善氣道炎癥狀態[10]。研究表明，β-catenin 可以通過Wnt/β-catenin信號通路調控哮喘的免疫炎癥及氣道重塑過程[11, 12]。但是，miR-3162-3p對OVA哮喘發病早期(致敏期)小鼠肺部炎癥反應的影響尚不清楚。本文采用腹腔轉染miR-3162-3p類似物mimic(以下簡稱mimic)，探討OVA致敏小鼠肺組織miR-3162-3p與β-catenin、炎癥反應之間的關系，明確miR-3162-3p對OVA致敏小鼠肺部炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 實驗小鼠24只購于廣東省醫學實驗動物中心；化學合成miR-3162-3p mimic為百奧邁科生物有限公司產品；miRNA qRT-PCR相關試劑盒購于Takara公司。miRNA RT-PCR Kit (RR716)、Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit(638313)、SYBR Premix Ex Taq II(RR820A)、RNAiso Plus(9108)、PrimeScriptTMRT Master Mix(RR036A)、IL-4 ELISA試劑盒(EK0405，武漢博士德生物有限公司)；EntransterTM-in vivo 試劑(18668-11-1，英格恩生物公司)；雞卵清蛋白OVA(A5503，Sigma)；氫氧化鋁(23918，Sigma)；引物合成(上海生工公司)。

1.2 動物分組及其處理 將6～8周雌性 BALB/c 小鼠24只隨機分為對照組、對照+mimic組、致敏組及致敏+mimic組，每組6只。致敏液為50 μg OVA和2 mg氫氧化鋁溶解于0.2 mL PBS配制而成。致敏組在實驗第1、7、14天腹腔注射致敏液，對照組致敏采用PBS替代；實驗第21、22、23天對照+mimic組、致敏+mimic組采用小動物體內轉染劑EntransterTM-in vivo將mimic轉染至小鼠腹腔，對照組和致敏組采用同體積5%葡萄糖水溶液(用于配制轉染劑EntransterTM-in vivo)替代。

1.3 肺泡灌洗液(BALF)檢測 實驗第24天取眼球血后處死小鼠，結扎左側支氣管，右側肺進行支氣管肺泡灌洗；灌洗后得到BALF行細胞總數及細胞分類檢測。

1.4 肺組織檢測 將左側肺切除后取部分肺組織放入4%甲醛固定液固定過夜，制作石蠟切片，HE染色后光鏡下觀察各組肺組織形態學改變。部分肺組織迅速轉移至-80 ℃冰箱保存，用于qRT-PCR和ELISA檢測。肺組織miR-3162-3p及β-catenin mRNA水平檢測嚴格按照qRT-PCR相關試劑盒說明書操作，采用LightCycler?480II 熒光定量 PCR 分析 miR-3162-3p及 β-catenin mRNA表達水平，得到數據采用2-ΔΔCt 值相對定量法分析。肺組織IL-4檢測采用ELISA試劑盒，檢測步驟參照試劑盒說明書。

2 結果

2.1 各組BALF細胞總數及其分類 與對照組比較，對照+mimic組BALF細胞總數增多；與致敏組比較，致敏+mimic組BALF細胞總數增多；對照+mimic組、致敏+mimic組BALF中細胞分類以巨噬細胞為主，巨噬細胞百分比較對照組、致敏組升高，而淋巴細胞百分比降低。見表1。

表1 各組BALF細胞總數及分類

注：與對照組比較，#P<0.05；與致敏組比較，*P<0.05；與對照+mimic組比較，△P<0.05。

2.2 各組肺組織病理改變 光學顯微鏡下HE染色，對照組肺組織結構清晰，肺泡間隔勻稱；對照+mimic組肺泡間隔不勻稱，肺氣道周圍或血管周圍的細胞浸潤增多；致敏組肺組織結構疏散不均勻，肺泡間隔增寬，氣道周圍可見少量炎性細浸潤；致敏+mimic組肺組織間質及肺泡腔可見大量炎細胞浸潤。

2.3 各組肺組織IL-4水平 對照組、對照+mimic組、致敏組、致敏+mimic組肺勻漿IL-4水平分別為(3.823±0.857)、(31.423±2.747)、(18.436±0.757)、(28.453±1.848)pg/mg。對照+mimic組、致敏+mimic組肺勻漿IL-4水平分別較對照組、致敏組增高，組間差異均有統計學意義(P均<0.05)。

2.4 各組肺組織miR-3162-3p及β-catenin mRNA表達 對照+mimic組和致敏+mimic組miR-3162-3p表達水平分別較對照組、致敏組增高，對照+mimic組和致敏+mimic組β-catenin mRNA的表達分別較對照組、致敏組降低，組間差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 各組肺組織miR-3162-3p及β-catenin mRNA表達

注：與對照組比較，*P<0.05；與致敏組比較，**P<0.05。

3 討論

目前，miRNA與哮喘的研究越來越受到重視[7, 13]，有研究者報道肺部特異性miRNA表達譜對于肺發育和維持肺穩態具有重要作用[14]。Williams等[15]通過高靈敏度的RT-PCR方法檢測正常人和輕度哮喘患者氣道活檢組織中miRNA表達，發現227個miRNA存在顯著表達差異。Chen[16]等發現了嚴重哮喘的miRNA表達網絡。miRNA的差異表達能通過激活氣道結構細胞和免疫細胞并誘導細胞因子釋放參與炎癥和促進氣道重塑，導致哮喘從輕度到嚴重階段進展[13]。考慮到獲取哮喘患者或正常人肺部活檢組織會造成創傷，而且哮喘多發生在兒童期，本課題組前期臨床研究著重于支氣管哮喘兒童和正常兒童的血液中差異miRNA。研究分析結果顯示其中的miR-3162-3p特異性高表達，很有可能成為區分哮喘兒童和正常兒童的分子診斷標記物[9]，miR-3162-3p靶向β-catenin加重哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道高反應性[10]。有研究發現，選擇性抑制小鼠miR-145表達后哮喘小鼠炎癥水平下降，可以達到激素治療的類似效果[17]，這提示針對miR-3162-3p有可能開發出治療哮喘的新型抑制劑或者基因治療新產品。

本文采用化學合成miR-3162-3p類似物mimic，轉染至OVA致敏小鼠后模擬內源性miR-3162-3p表達水平上升，探討miR-3162-3p在哮喘發病的致敏期對炎癥反應的影響，為miRNA在臨床哮喘分類分級診斷和治療提供理論依據。本研究發現miR-3162-3p mimic腹腔轉染后OVA致敏小鼠BALF中巨噬細胞比例大幅上升，而淋巴細胞比例下降明顯。巨噬細胞和淋巴細胞是體內炎癥反應的重要免疫細胞，免疫系統受多種類型細胞基因的動態調節控制。miRNA能控制特定細胞類型的信號通路，影響免疫細胞的發育和表型穩定性，調節組織中炎癥反應[18]。因此，miR-3162-3p可能通過調節免疫系統來促發肺部炎癥反應。IL-4是Th2型細胞因子，是哮喘的重要炎癥因子之一[19]。本研究在OVA致敏小鼠模型中發現，miR-3162-3p mimic可促進肺部炎癥因子IL-4表達上升，同時還明顯增加肺組織炎癥細胞浸潤程度，提示miR-3162-3p在哮喘發病過程的早期可能已經發揮功能。

β-catenin 蛋白是 Wnt/β-catenin 信號通路的重要組成部分，其異常表達與多種人類疾病的發生發展有重要聯系。Reuter等[20]證實了Wnt/β-catenin信號通路在DC介導的肺部過敏炎癥反應中有重要作用。Kwak等[21]研究發現哮喘患者與慢性哮喘小鼠在哮喘發作時Wnt 5a、Wnt 7a及β-catenin表達增高，過敏原或外來的炎癥損害能介導Wnt/β-catenin通路。本文結果顯示，與對照組比較過敏原OVA致敏能提高肺β-catenin mRNA的表達水平。我們之前研究結果顯示，OVA激發后的哮喘小鼠肺組織中miR-3162-3p表達水平顯著上升，能降低β-catenin蛋白的表達水平[10]。由此推測，miR-3162-3p 和OVA致敏在哮喘發病過程中可能協同影響β-catenin蛋白表達水平，其具體作用機制有待進一步深入探討。

綜上所述，miR-3162-3p可能通過下調靶蛋白β-catenin的表達來調節OVA致敏小鼠的肺部炎癥，促進肺部炎癥細胞浸潤以及炎癥因子表達。