生姜對卵巢癌發生作用的有效活性成分及其潛在基因靶點

葛靜，何燕南

天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津300112

卵巢癌作為臨床婦產科較為常見的疾病之一，其發病原因與遺傳、內分泌因素等存在密切相關性。疼痛、月經不調以及消瘦等是卵巢癌的主要臨床表現，部分患者還會伴有腹部包塊以及腹腔積液等病癥[1，2]。該病若不及時進行治療，可擴散到子宮等重要器官，嚴重者可危及卵巢癌患者生命。近年來，隨著社會生活習慣的改變，卵巢癌的發病率及其病死率呈現逐年遞增趨勢[3]。因此，積極尋求一種有效治療卵巢癌的方式尤為重要。中醫學認為卵巢癌屬“癥瘕”、“積聚”等范疇，病因多為自身正氣虛羸，加之外感風寒，內傷食滯，進而導致水谷不化、痰濁內生、濕熱蘊結、脈絡瘀阻，遷延日久，漸成癥瘕，故以養血散寒、溫陽化瘀、散結抑瘤為治療原則[4，5]。網絡藥理學具有整體性、系統性特點，與中藥辨證論治具有較高的契合度[6，7]。中藥生姜具有解表散寒、開痰以及抗腫瘤之功效?；诖耍狙芯繑M通過網絡藥理學的方法對生姜的有效活性成分及其靶基因進行預測，為臨床進一步研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 篩選生姜主要活性成分及靶基因 通過網頁(TSMP)對生姜的活性成分及其靶基因進行篩選。篩選生姜活性成分選用兩個指標，即口服生物利用度(OB)以及類藥性(DL)，其中生姜活性成分篩選標準為：OB>30% 且DL>0.18；之后對篩選出的主要活性成分通過TSMP進行相關靶基因預測。

1.2 預測作用于卵巢癌潛在的靶點基因 借助genecard 數據庫預測可能作用于卵巢癌的靶基因，與此同時通過TCGA數據庫中篩選出卵巢癌具有高表達的基因，進而獲得所有已知與卵巢癌相關的基因靶點。

1.3 繪制韋恩圖 為明確卵巢癌相關靶基因與中藥生姜潛在靶基因之間的相互作用，將TSMP所預測靶基因、genecard 數據庫預測的可能作用于卵巢癌的靶基因以及TCGA數據庫中篩選出卵巢癌中具有高表達的基因進行交集，并使用R軟件包limma繪制韋恩圖。

1.4 構建生姜-卵巢癌靶基因網絡 將預測到的生姜作用于卵巢癌的主要活性成分，以及篩選出卵巢癌中具有高表達的交集靶基因和卵巢癌進行構建，即形成生姜成分-交集靶基因-卵巢癌調控網絡。

1.5 驗證預測基因及對目標靶基因進行生存分析 應用GEO的數據集對其目標靶基因進行驗證。首先下載卵巢癌的數據集GSE26712(185個卵巢癌組織、10個癌旁組織)，然后做盒型圖，最后將其結果與正常組織進行對比分析。目標靶基因表達驗證之后，利用KM在線數據庫評估目標靶點基因對卵巢癌的影響。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0統計學軟件進行數據分析。計數資料以個數和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生姜活性成分及靶基因 本研究通過TSMP數據庫總共篩選出中藥生姜的5種活性成分，分別為Dihydrocapsaicin、6-methylgingediacetate2、Poriferast-5-en-3beta-ol、Beta-sitosterol、Stigmasterol。對上述5中活性成分分別通過TSMP數據庫進行靶點預測，得出2個主要活性成分具有靶點基因：即MOL000358(Beta-sitosterol)和MOL000449(Stigmasterol)，總共篩選出166個靶點基因。生姜活性成分篩選情況如表1。

2.2 卵巢癌潛在靶基因 通過genecard 數據共預測篩選出可能作用卵巢癌的靶基因，總共為6 892個；之后利用TCGA數據庫中篩選出卵巢癌中具有高表達的靶基因，總共為200個。

表1 生姜活性成分的篩選情況

2.3 生姜成分-卵巢癌靶點基因韋恩圖 將生姜成分靶點基因、TCGA卵巢癌差異基因以及Gene cards卵巢癌靶點基因應用R軟件包limma繪制韋恩圖，總共獲得交集靶點基因4個， 即CLDN3、CLDN4、FOLR、MSLN。如圖1。

圖1 生姜成分-卵巢癌靶點基因韋恩圖

2.4 生姜成分-卵巢癌目標靶點基因網絡 將上述篩選出生姜2個活性成分和交集靶基因以及卵巢癌靶點基因進行共同構建：得出生姜成分-交集靶基因-卵巢癌基因調控網絡。如圖2。

圖2 生姜成分-卵巢癌靶點基因網絡構建

2.5 目標靶點基因驗證結果 網絡構建后，對所預測的靶點基因應用GEO的數據集進行驗證(是否在卵巢癌中高表達)。下載卵巢癌的數據集GSE26712(185個卵巢癌組織、10個癌旁組織)并做盒型圖，其結果顯示與正常組織相比，網絡中的靶點基因(CLDN3、CLDN4、FOLR、MSLN)在卵巢癌組織表達顯著增高，且組間對比具有統計學差異(P<0.05)。如圖3。

圖3 目標靶點基因的驗證

2.6 目標靶點基因的生存預后結果 目標靶點基因驗證后，對所驗證的靶點基因應用KM在線數據庫進行評估(是否能影響卵巢癌患者的生存預后)。其結果顯示網絡中的目標靶點基因(CLDN3、CLDN4、FOLR、MSLN)均可影響卵巢癌患者的生存預后(P<0.05)。如圖4。

3 討論

卵巢癌早期診斷困難，且易轉移復發，若不及時進行治療，不僅影響患者的生活質量，嚴重者甚至危及患者生命[8,9]。中醫學上卵巢癌的臨床表現見于 “癥瘕”、“石瘕”等病證之中，其發病機理主要為血虛寒凝、痰濕瘀結，與厥陰肝寒存在密切聯系。肝經循行之處是卵巢癌的發生部位，以肝為先天，經、帶、胎、產數傷于血，加之素體陽虛，寒濕內生，濕聚為痰，痰阻氣機，日久寒凝濕滯，痰瘀痹阻胞脈，結聚卵巢，進而發病[10～12]。目前，化療常常作為臨床治療卵巢癌的首選治療方式。盡管隨著醫療技術的不斷發展以及化療的逐步規范，其不良反應呈現逐漸降低趨勢，但卵巢癌總體生存率并無明顯提高。因此，研究新的卵巢癌靶向治療藥物十分必要[13]。

圖4 目標靶點基因的生存預后結果

中藥材生姜可藥食兩用，具有發汗解表、溫中止嘔、溫肺止咳、解藥毒的作用[14]。生姜味辛、微溫，經五臟除風邪寒熱，止咳吐，去痰下氣。生姜的辛辣主要體現在姜辣素，姜辣素主要包括姜酚以及姜烯酚等成分，其中姜酚類是其主要活性成分[15,16]。有報道顯示，姜酚類化合物的主要生物活性具有抗腫瘤以及抗氧化、抗炎等功效[17]。雖然對生姜的各主要活性成分的藥理學作用已基本明確，但是治療卵巢癌的確切靶點卻少有報道。

為了研究生姜治療卵巢癌的作用靶點，本研究采用網絡藥理學方法[18]，通過TSMP數據庫研究篩選生姜的有效活性成分及其相關靶點基因，同時構建生姜活性成分-目標靶點基因網絡；并借助其主要活性成分-潛在靶點基因之間的互作網絡，進而分析探究生姜治療卵巢癌的作用機制。通過網絡藥理學方法我們發現，生姜中總共有5種活性成分，即Dihydrocapsaicin、6-methylgingediacetate2、Poriferast-5-en-3beta-ol、Beta-sitosterol、Stigmasterol，最終得出2種主要活性成分即Beta-sitosterol、Stigmasterol具有靶點基因，這可能是其抗卵巢癌的物質基礎。與Beta-sitosterol、Stigmasterol密切相關的潛在靶點基因總共為166個，通過genecard 數據庫總共篩選出可能作用卵巢癌的靶基因6 892個，并利用TCGA數據庫中篩選出卵巢癌中具有高表達的靶基因200個。為明確卵巢癌相關靶基因與中藥生姜潛在靶基因之間的相互作用，我們將TSMP預測的靶基因、genecard 數據庫預測的可能作用于卵巢癌的靶基因以及TCGA數據庫中篩選出的卵巢癌中具有高表達的基因采取R軟件包limma繪制韋恩圖，得出其交集基靶因；之后通過對調控網絡的分析，我們發現CLDN3、CLDN4、FOLR、MSLN可能是生姜抗卵巢癌中較為核心的干預靶點基因。網絡構建后，我們對所預測的靶點基因應用GEO的數據集進行驗證，其結果顯示與正常組織相比，網絡中的靶點基因(CLDN3、CLDN4、FOLR、MSLN)在卵巢癌組織表達顯著增高，且具有統計學差異。在目標靶點基因的驗證后，我們對所驗證的靶點基因應用KM在線數據庫進行評估，其結果顯示網絡中的目標靶點基因(CLDN3、CLDN4、FOLR、MSLN)均可影響卵巢癌患者的生存預后。這進一步印證了之前的分析結果，生姜可干預多個與卵巢癌密切相關的基因靶點的表達。