腺苷預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后Caspase-3的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

龐艷利，許二妮，尉娜，殷闖，譚軍

1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院

腦卒中是神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)病、多發(fā)病，是導(dǎo)致患者死亡和殘疾的主要原因，其中缺血性腦卒中占全部腦卒中的80%以上[1，2]。對(duì)于缺血性腦卒中的治療，目前臨床除了一般抗血小板、穩(wěn)定斑塊、腦保護(hù)等治療外，還應(yīng)用靜脈溶栓及機(jī)械取栓術(shù)以恢復(fù)腦組織的血流，達(dá)到挽救缺血半暗帶，減少最終梗死面積，并改善臨床預(yù)后的目的。然而血流再通后部分患者神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度沒(méi)有任何改善，甚至可能進(jìn)一步惡化，即缺血再灌注損傷[3]。以往研究表明缺血再灌注損傷可加重腦卒中的嚴(yán)重程度，腺苷預(yù)處理可減輕缺血再灌注損傷[4～6]，細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷的機(jī)制之一[7]。為此，本研究就腺苷預(yù)處理對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注損傷后Caspase-3的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料 75只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～280 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于溫濕度適宜、通風(fēng)良好的動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由飲食、水。其他材料有：MCAO栓線(型號(hào)2636-A4，北京西濃科技有限公司)、腺苷、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(索萊寶科技有限公司)、抗Caspase-3抗體(英國(guó)Cohesion Biosciences公司)、兔SP試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)、顯微鏡(尼康儀器有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組及造模前準(zhǔn)備 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將75只雄性Sprague-Dawley大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(IR組)及腺苷預(yù)處理缺血再灌注組(AP組)，每組25只。AP組術(shù)前3 d腹腔注射腺苷注射液(劑量為1.5 mg/kg 生理鹽水稀釋至2 mL)，1次/d；Sham組及IR組術(shù)前3 d腹腔注射等量生理鹽水，1次/d。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，禁水2 h。

1.3 大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注模型的制備 參照 Longa 等[8]的方法并加以改良對(duì)IR組及AP組制備大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注模型。對(duì)即將進(jìn)行手術(shù)的大鼠給予10%水合氯醛(3.0 mL/kg)腹腔麻醉，通過(guò)疼痛刺激判斷是否麻醉成功，后將其以仰臥位固定于大鼠專(zhuān)用手術(shù)臺(tái)上。對(duì)大鼠頸部皮膚進(jìn)行備皮及碘伏消毒后，止血鉗提起頸部皮膚，用手術(shù)刀沿大鼠頸部正中偏左0.5 cm處縱向切開(kāi)3 cm 左右的皮膚，逐層鈍性分離筋膜、肌肉及神經(jīng)等組織，充分暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈( CCA)、頸外動(dòng)脈ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈( ICA)。用無(wú)菌線結(jié)扎ECA、CCA的近心端，用動(dòng)脈夾夾閉ICA，在CCA上距ECA、ICA分叉處下方0.5 cm處，用眼科剪剪一“V”型切口，將MCAO栓線輕輕插入切口，當(dāng)栓線頭端到達(dá)ICA后，用無(wú)菌線結(jié)扎固定栓線并松開(kāi)夾閉ICA的動(dòng)脈夾，繼續(xù)插入栓線至大腦中動(dòng)脈( MCA)處阻斷其血流，插入的深度18～20 mm。逐層縫合、消毒，記號(hào)筆標(biāo)記栓線的皮膚外部分并將其縫合固定于胸前皮膚。術(shù)中及術(shù)后注意保持動(dòng)物體溫，腹腔注射2 mL生理鹽水防止大鼠術(shù)后脫水。術(shù)后2 h即大腦中動(dòng)脈栓塞2 h后，將栓線向外拔1.0 cm左右，使其大腦的Willis環(huán)及MCA恢復(fù)血液供應(yīng)。Sham組不插入線栓阻塞大腦中動(dòng)脈，余步驟同IR組及AP組。待大鼠術(shù)后蘇醒，按Zea Longa的五分制評(píng)分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分。納入標(biāo)準(zhǔn)為1～3 分，排除標(biāo)準(zhǔn)為0分、4分或死亡的，并隨時(shí)補(bǔ)充各組大鼠保證每組大鼠數(shù)量一致。

1.4 腦梗死體積量化 缺血2 h再灌注24 h時(shí)，三組各隨機(jī)抽取5只大鼠，10%水合氯醛過(guò)量麻醉后快速斷頭取腦，除去嗅球、低位腦干及小腦，于-20 ℃冰箱快速冰凍20 min，取出后快速連續(xù)冠狀位切片，片厚約2 mm，將腦片完全浸入2% TTC染液中，在37 ℃溫箱中避光染色30 min，每隔10 min翻動(dòng)一次腦片使其均勻接觸染液。TTC染色后正常腦組織呈紅色，梗死區(qū)呈蒼白色。拍照后使用Image J圖像分析系統(tǒng)對(duì)腦梗死體積進(jìn)行量化。根據(jù)以下公式計(jì)算腦梗死體積百分比：腦梗死體積百分比=(梗死面積×切片厚度)/(全腦面積×切片厚度)×100%≈梗死面積/全腦面積×100%。

1.5 灌注取腦組織 三組余20只分別取5只于缺血2 h再灌注6、24、48、72 h時(shí)，10%水合氯醛(3.0 mL/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物，仰臥位固定于大鼠手術(shù)臺(tái)上并置于解剖盤(pán)中，開(kāi)胸暴露心臟，用50 mL注射器從左心室插入至升主動(dòng)脈，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，灌注生理鹽水至流出液基本澄清，同時(shí)可看到眼球、肝臟、四肢變白，即灌注4% 多聚甲醛溶液至頸部、四肢僵直。將灌注成功的大鼠快速斷頭取腦，取視交叉前后各2 mm腦冠狀切片置于4%多聚甲醛溶液中，于4 ℃冰箱固定24 h。將固定好的腦組織進(jìn)行脫水透明，浸蠟包埋后切片，片厚4 μm。

1.6 腦組織細(xì)胞凋亡程度檢測(cè) 采用TUNEL法。切片脫蠟水化后，滴加蛋白酶K于37 ℃孵箱避光孵育30 min，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶強(qiáng)力封閉液室溫孵育20 min，TUNEL反應(yīng)液37 ℃避光孵育60 min，Streptavidin-HRP工作液室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照組僅滴加50 μL生物素(Biotin)標(biāo)記的dUTP液，余步驟與上述一致。光鏡下胞核被染成棕黃色或棕褐色的細(xì)胞是凋亡細(xì)胞的表現(xiàn)，每張切片隨機(jī)選取缺血側(cè)皮質(zhì)5個(gè)不重疊高倍視野(×400)采集圖像，采用Image J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值。

1.7 腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法。將烤好的切片脫蠟水化后，高壓鍋抗原修復(fù)5 min；內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑室溫避光孵育20 min；正常山羊血清室溫封閉30 min；一抗(Caspase-3 1∶100)4 ℃冰箱過(guò)夜；PBS浸洗后滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物，室溫濕盒中孵育20 min；PBS浸洗后滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，室溫濕盒中孵育20 min； PBS浸洗后DAB染色，鏡下觀察染色，自來(lái)水沖洗終止染色；蘇木素復(fù)染1 min，鹽酸乙醇分化數(shù)秒，脫水、透明、封片。陰性對(duì)照組用PBS代替一抗，余步驟與上述一致。光鏡下可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈淡黃色或棕黃色，每張切片隨機(jī)選取缺血側(cè)皮質(zhì)5個(gè)不重疊高倍視野(×400)采集圖像，采用Image J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠缺血再灌注24 h腦梗死體積變化 Sham組、IR 組、AP組缺血再灌注24 h相對(duì)梗死體積分別為(0.00±0.000)%、(0.28±0.023)%、(0.09±0.018) %，組間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。

2.2 三組缺血再灌注不同時(shí)刻腦組織中Caspase-3蛋白表達(dá) Sham組、IR 組、AP組缺血再灌注不同時(shí)刻腦組織中Caspase-3蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組不同時(shí)刻腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)比較

注：與Sham組比較，aP<0.05；與IR組比較，bP<0.05。

2.3 三組缺血再灌注不同時(shí)刻腦組織細(xì)胞凋亡情況 Sham組、IR 組、AP組缺血再灌注不同時(shí)刻腦組織細(xì)胞凋亡差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 三組大鼠不同時(shí)刻腦組織細(xì)胞凋亡比較

注：與Sham組比較，aP<0.05；與IR組比較，bP<0.05。

3 討論

既往研究認(rèn)為，缺血性腦卒中患者早期大腦再灌注對(duì)疾病進(jìn)展及預(yù)后起著關(guān)鍵作用[9]。發(fā)病早期(3～4.5 h)在排除相關(guān)禁忌證的情況下，可采用靜脈溶栓治療恢復(fù)血流。然而臨床實(shí)踐顯示，該治療并非所有溶栓患者均能獲益，甚至有部分患者病情進(jìn)一步加重，其主要并發(fā)癥有溶栓后出血、溶栓后血管再閉塞、再灌注損傷等。因此，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注再灌注損傷。靜脈溶栓可恢復(fù)血流，然而血流再通和血流再灌注不同，血流再通即閉塞的動(dòng)脈再開(kāi)放，而血流灌注是再通動(dòng)脈下游的微循環(huán)血流的恢復(fù)[10]。血流再通而血流再灌注失敗導(dǎo)致腦組織病變進(jìn)一步加重，即缺血再灌注損傷；其病理過(guò)程主要包括血腦屏障的破壞、興奮性氨基酸(主要包括谷氨酸和天冬氨酸)毒性、自由基(主要包括氧自由基和脂質(zhì)自由基)損傷作用、Ca2+超載、炎癥反應(yīng)、NO 毒性、線粒體功能障礙及細(xì)胞凋亡/壞死等[7,10]。

腦組織持續(xù)存在缺血缺氧損傷會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡，這是腦梗死程度進(jìn)一步加重的主要機(jī)制之一[11]。程序性細(xì)胞死亡途徑分為線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑、死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑、穿孔素/顆粒酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑[12]。雖然途徑各不相同，但它們最終都會(huì)導(dǎo)致一系列Caspase家族成員的激活，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡。目前已發(fā)現(xiàn)10多種Caspase家族成員，根據(jù)其功能將它們分為兩類(lèi)，一類(lèi)為啟動(dòng)者如Caspase-2、8、9、10，受到信號(hào)刺激后可啟動(dòng)死亡程序；一類(lèi)為執(zhí)行者如Caspase-3、6、7，它們可直接降解細(xì)胞關(guān)鍵的細(xì)胞組分，促使細(xì)胞凋亡[13]。Caspase-3是Caspase家族最關(guān)鍵的蛋白酶，各種信號(hào)啟動(dòng)的凋亡程序最終均可激活Caspase-3。Caspase-3是一種凋亡執(zhí)行蛋白酶[14]，激活后可引起與DNA修復(fù)、mRNA裂解、類(lèi)固醇合成及細(xì)胞骨架重建等有關(guān)的功能蛋白的降解，導(dǎo)致核質(zhì)濃縮，核膜、核仁碎裂，DNA裂解和mRNA衰變等，引起細(xì)胞凋亡。神經(jīng)元缺血缺氧后可激活Caspase-3 蛋白，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[15]。

腺苷即腺嘌呤核苷, 由腺嘌呤和戊糖結(jié)合而成，是一種普遍存在于人體細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性核苷。腺苷是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)劑，通過(guò)A1R、A2aR、A2bR和A3R四種腺苷受體啟動(dòng)其生物學(xué)效應(yīng)[16]，可介導(dǎo)心血管系統(tǒng)、腫瘤、炎癥、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)系統(tǒng)等相關(guān)的多種生理過(guò)程[17]。在本課題組之前的研究基礎(chǔ)之上，我們觀察腺苷預(yù)處理對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注損傷后Caspase-3的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，探討其通過(guò)抗凋亡機(jī)制發(fā)揮的腦保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Sham組各時(shí)間點(diǎn)均可偶見(jiàn)Caspase-3及凋亡細(xì)胞表達(dá)，而IR組Caspase-3及凋亡細(xì)胞表達(dá)較同一時(shí)刻Sham組明顯增加，AP組Caspase-3及凋亡細(xì)胞表達(dá)較同一時(shí)刻IR組明顯減少；TTC染色檢測(cè)缺血再灌注24 h腦梗死體積中也發(fā)現(xiàn)，AP組的梗死體積較IR組明顯減少。Caspase-3表達(dá)變化趨勢(shì)在缺血再灌注損傷后與凋亡細(xì)胞變化趨勢(shì)一致，均在6 h開(kāi)始出現(xiàn)，并呈時(shí)間依賴(lài)性變化，48 h出現(xiàn)表達(dá)高峰，72 h開(kāi)始下降，這與羅銀利等[18]研究結(jié)果基本一致。本研究Sham組偶見(jiàn)Caspase-3蛋白表達(dá)，也存在細(xì)胞凋亡，這與袁瓊蘭等[19]研究結(jié)果一致；提示正常生命體要通過(guò)程序性死亡清除無(wú)用的、衰老的及具有潛在危害的細(xì)胞。本研究IR組Caspase-3 蛋白表達(dá)增多、細(xì)胞凋亡增多，且Caspase-3表達(dá)變化趨勢(shì)在缺血再灌注損傷后與凋亡細(xì)胞變化趨勢(shì)一致，這與馮磊等[20]研究結(jié)果一致；提示Caspase-3蛋白參與了缺血再灌注損傷病理過(guò)程，啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡過(guò)程，加重了腦梗死程度；而AP組各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3及凋亡細(xì)胞表達(dá)變化趨勢(shì)與IR組一致，但其表達(dá)較同一時(shí)刻IR組明顯減少；提示腺苷預(yù)處理降低了Caspase-3凋亡執(zhí)行蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡及降低缺血再灌注損傷造成的腦梗死體積，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。