HMGB1和TLR4在高血壓合并頸動脈硬化患者外周血中的表達及作用

蔡飛，劉建勇，滕云飛，李海濤

華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院,武漢430022

原發性高血壓是臨床常見的一種慢性疾病，是誘發頸動脈硬化的獨立危險因素[1,2]。目前研究認為，慢性炎癥反應參與高血壓的病理過程[3]，并可能促進了頸動脈硬化的發生。高遷移率族蛋白 B1(HMGB1)是一種非組蛋白染色體蛋白質，廣泛存在于真核細胞的核內。機體受損時，HMGB1通過機體釋放壞死細胞或通過炎性細胞分泌轉移至細胞外，作為炎癥介質，啟動機體的免疫應答[4,5]。HMGB1能激活靶細胞的Toll樣受體4(TLR4)，可通過細胞遷移、增殖及活化來促進炎癥反應的發生，其促炎作用可導致下游相關炎癥因子如IL-6、IL-17以及TNFα等的釋放[6]。已有研究發現，HMGB1/TLR4軸激活參與了原發性高血壓的病理過程[7]。為此，本研究檢測高血壓合并頸動脈硬化患者的外周血HMGB1、TLR4表達水平，并分析二者與相關炎癥因子表達的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集本院2018年1月～2019年5月臨床確診的高血壓患者186例，根據頸動脈超聲結果分為兩組。單純高血壓組74例，男40例、女34例，年齡(62.3±8.2)歲；高血壓合并頸動脈硬化組79例，男40例、女39例，年齡(64.6±7.5)歲。納入標準:①符合2010版中國高血壓防治指南原發性高血壓的診斷標準；②同意接受頸動脈超聲檢查；③無自身免疫性疾病、感染等明確與炎癥因子相關的疾病；④患者知情并同意該研究方案。排除標準：①不符合上述診斷標準和納入標準者；②各種繼發性高血壓；③類風濕關節炎、系統性紅斑狼疫等結締組織病以及急慢性感染性疾病正接受抗炎治療患者。選擇同期健康體檢無任何器官功能障礙者90例為對照組，男47例、女43例，年齡(60.6±9.1)歲。以上三組性別和年齡比較均無統計學差異(P均>0.05)。

1.2 頸動脈超聲檢查 患者仰臥位，探頭沿頸動脈走向自下向上作連續縱橫切面掃查，測量頸動脈內-中膜厚度(IMT)，測量工作由兩位臨床工作超過10年的超聲科醫師完成。IMT < 1.00 mm為正常，1.00～1.20 mm為頸動脈內膜增厚，>1.20 mm為存在頸動脈粥樣硬化斑塊。

1.3 血清HMGB1、TLR4 、IL-17、IL-6水平檢測 三組取空腹12 h后靜脈血5 mL，采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清HMGB1和TLR4水平，ELISA法檢測各組血清IL-17、IL-6水平；所有檢測操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 外周血單核細胞HMGB1和TLR4 蛋白水平測定 從每個樣本中分別取 100 μL抗凝全血，分別加入 20 μL PE 標記抗體，充分混勻后室溫孵育 40 min。用標本處理儀進行細胞固定和破膜，3 000 r/min 離心5 min，棄上清液。用 3 mL Stain buffer(pH7.4的磷酸緩沖液加2%小牛血清和 0.1% 疊氮鈉) 緩慢沖洗2遍，加入 500 mL Stain buffer，輕輕搖勻呈細胞懸液，上流式細胞儀測定各組外周血單核細胞 HMGB1和TLR4蛋白表達水平。

2 結果

2.1 三組IMT變化 對照組、單純高血壓組、高血壓合并頸動脈硬化組患者IMT分別為(0.87±0.07)、(0.98±0.06)、(1.23±0.14)mm。高血壓合并頸動脈硬化組患者IMT均大于單純高血壓組和對照組，單純高血壓組IMT亦大于對照者(P均<0. 05)。

2.2 三組血清HMGB1、TLR4、IL-17、IL-6水平變化 三組血清HMGB1、TLR4、IL-17、IL-6水平比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 三組血清HMGB1、TLR4、IL-17、IL-6水平比較

注：與正常對照組相比；*P<0.05；與單純高血壓組相比，#P<0.05。

2.3 三組外周血單核細胞HMGB1、TLR4表達變化 三組外周血單核細胞均能檢測到HMGB1和TLR4蛋白表達，高血壓合并頸動脈硬化組患者單核細胞HMGB1和TLR4表達均高于單純高血壓組和對照組，單純高血壓組單核細胞HMGB1和TLR4表達亦高于對照者(P均<0. 05)。見圖1。

注：A 為正常對照組、B為單純高血壓組、C 為高血壓合并頸動脈硬化組；縱坐標為細胞數，橫坐標為熒光強度；峰值越右移，熒光強度越強，HMGB1和TLR4蛋白表達量越高。

圖1 流式細胞術檢測各組外周血單核細胞HMGB1和TLR4蛋白水平表達

2.4 血清HMGB1、TLR4、IL-17、IL-6的相關性 Spearman相關性分析顯示，高血壓患者血清HMGB1、TLR4水平與IL-17、IL-6水平呈正相關。見表2。

表2 HMGB1、TLR4水平與IL-17、IL-6水平相關性

3 討論

頸動脈是高血壓最易累及病變的大血管。由于長期處于壓力超負荷狀態，血管平滑肌細胞和成纖維細胞增生遷移，表現為血管壁增厚和管腔縮小，最終導致頸動脈硬化[8]。目前研究發現，無論是高血壓還是頸動脈硬化，都與細胞炎性反應密切相關，炎性反應因子可作為預測心腦血管疾病發生的重要指標[9]。

研究發現，HMGB1在AngⅡ誘導的血管平滑肌細胞表型轉化模型中升高，表現為收縮蛋白的下調和合成蛋白的上調，HMGB1和氯沙坦基因敲除模型可阻斷表型轉化[10]。當HMGB1刺激培養的人血管平滑肌細胞時，IL-1β的生成明顯增加。HMGB1還增加NLRP3炎癥成分的表達，包括NLRP3、ASC和caspase-1。在TLR 4缺陷細胞中，HMGB1誘導的caspase-1表達明顯減弱，轉染caspase-1 siRNA的細胞以及TLR4單克隆抗體或siRNAs處理的細胞，IL-1β的產生均明顯降低[11]。在冠心病患者血清中，IL-6和TLR 4內源性配體HMGB1水平明顯高于正常人。冠心病患者血清HMGB1水平與IL-6水平呈正相關，HMGB 1和IL-6在冠心病患者動脈粥樣硬化組織中均有表達[12]。在缺氧導致的新生兒肺動脈高壓中，患兒血清HMGB1水平明顯高于健康對照組，肺動脈高壓消解后HMGB1水平顯著降低，且HMGB1的變化與血清TNF-α和IL-6水平呈正相關[13]。已有研究證實，血漿IL-17水平與頸動脈內中膜厚度值呈正相關，提示原發性高血壓患者隨著頸動脈內中膜厚度增厚，IL-17濃度相應增高，表明血漿IL-17的濃度是間接反映高血壓并動脈硬化的進展程度的重要指標[14]。HMGB1、TLR4在高血壓促炎過程中擔任著重要角色，可能成為高血壓患者血管重塑的新的生物標志物。

本研究顯示，高血壓合并頸動脈硬化組患者血清HMGB1和TLR4表達水平高于單純高血壓組，單純高血壓組血清HMGB1和TLR4表達水平高于對照組，高血壓患者通常存在高HMGB1和TRL4血癥，說明長期高血壓可導致機體的慢性炎癥反應。外周血單核細胞的HMGB1和TRL4水平顯著高于對照組，說明高血壓狀態下炎癥因子HMGB1和TRL4蛋白表達增高。本研究檢測HMGB1、TRL4在血清和單核細胞中的表達水平，旨在從兩個不同的方面確定高血壓狀態下慢性炎癥的存在。本研究還發現，高血壓合并頸動脈硬化患者通常存在高IL-17和IL-6血癥，血清IL-17和IL-6水平顯著高于單純高血壓組、對照組。線性相關分析結果顯示，HMGB1、TRL4水平與IL-17、IL-6水平呈正相關，提示原發性高血壓患者隨著頸動脈內中膜厚度增厚，HMGB1和TRL4水平升高，IL-17和IL-6濃度也相應增高，表明HMGB1和TRL4是參與高血壓及其并發癥進展的重要因素。其機制可能為：HMGB1和TRL4結合，啟動炎癥反應，炎性細胞因子可通過多種途徑進入或作用于平滑肌細胞，導致頸動脈硬化。

綜上所述，高血壓合并頸動脈硬化患者外周血炎性因子活性和蛋白表達水平表達增加，檢測外周血生物學指標可為頸動脈硬化早期診斷及臨床治療確定靶標。