吳茱萸堿通過阻滯細胞周期而抑制人骨肉瘤細胞增殖

徐繪華 蘇文洲 陳存特 黃千峰 黃智通 郭奇峰

1 廣州市第一人民醫院(廣州 510180) 2 廣東省婦幼保健院(廣州 511400)

骨肉瘤是兒童和青少年最常診斷的骨原發性惡性腫瘤[1- 2]。在小于24歲患者的發病率在全球范圍內基本一致， 骨肉瘤患者男女比例約為1.40:1，在男性中比在女性中更常見[3]。骨肉瘤病因尚未完全明確，其中可能與患者特征相關的因素包括年齡，性別，種族，生長和身高，遺傳和家族因素以及先天存在的骨骼異常。遺傳畸變可能是發生骨肉瘤的重要因素之一[4]。在1970年之前，骨肉瘤的治療主要取決于手術切除，導致5年生存率低于20%，到90年代，5年生存率增加至70%左右[5]。目前，用于治療骨肉瘤的標準化療方案為多柔比星、甲氨蝶呤加上順鉑等新輔助化療組合[6- 7]。即使有了這些干預措施，骨肉瘤患者的臨床治療結果在近30年來沒有得到明顯改善。有效的化療藥物是提高患者臨床治療效果的重要途徑，因此，迫切需要開發更多的高效化療藥物。

吳茱萸堿是傳統中藥吳茱萸中主要的成分，具有抗腫瘤、抗炎、免疫調節等藥理作用[8]。目前研究表明，吳茱萸堿具有廣泛而強大的抗腫瘤活性，抗腫瘤譜包括胃癌、結腸癌、肝癌、肺癌、腎癌等[9]。國內外眾多研究表明吳茱萸堿能顯著抑制多種腫瘤細胞活性，其作用機制涉及細胞凋亡、誘導周期阻滯以及破壞相關膜蛋白等。但目前研究主要集中在肺癌、胃癌、肝癌、腎癌等領域[10-11]，極少有其對骨肉瘤作用的研究，吳茱萸堿在骨肉瘤的作用機制目前尚未清楚，在本文中我們利用體外細胞實驗來探討吳茱萸堿對骨肉瘤HOS細胞增殖、周期的變化，為吳茱萸堿抗骨肉瘤提供新的證據。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤細胞株HOS細胞購自中科院上海細胞庫；吳茱萸堿MedChemExpress(MCM美國)；MEM培養基、青霉素-鏈霉素雙抗溶液(美國GIBCO公司)；細胞周期檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；TRIzol Reagent(Ambion)；逆轉錄試劑盒、擴增試劑盒(美國Takara)；胰蛋白酶(0.25% Trypsin、0.25% Trypsin-EDTA)(Gibco 加拿大)；結晶紫溶液(碧云天生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：人骨肉瘤HOS細胞的培養條件為37℃、濕度為95%、CO2含量為5%的恒溫培養箱環境。人骨肉瘤HOS細胞所用的完全培養基為含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的MEM培養基。細胞培養時隔天更換培養基，2 d傳代1次，傳代比例為1:2。

1.2.2 Hoechst- 33258熒光染色觀察經不同濃度：吳茱萸堿處理后骨肉瘤HOS細胞核的形態學變化：取對數生長期的HOS細胞，消化重懸細胞并計數，按2×105個/孔，將其種植于6孔板爬片，培養6～8 h待其完全貼壁，吸盡殘余培養液，分別加入濃度為3、6、12 μmol/L的含吳茱萸堿的完全培養基[12]，實驗對照組只加等體積完全培養基，48 h后吸盡液體，加入0.5 mL固定液，固定10 min，去固定液，PBS洗滌2遍。Hoechst- 33258染色液，染色5 min，去染色液，PBS洗滌2遍。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，將貼有細胞的蓋玻片取出，讓細胞面朝下接觸封片液覆蓋載玻片。熒光顯微鏡下觀察并拍照，激發波長到350 nm，發射波長到460 nm。

1.2.3 細胞周期實驗：常規觀察并調整培養瓶內的細胞生長密度以及每瓶細胞狀態，實驗當天取處于對數生長期的骨肉瘤HOS細胞進行實驗。按1×106個細胞/皿接種在6 cm直徑的培養皿中，培養過夜，待細胞貼壁后，更換含有3 μmol/L 吳茱萸堿的完全培養基繼續培養。 加藥分別培養24、48、72 h后，消化計數得到5×105個細胞/管的細胞懸液，轉移至流式管中，離心重懸并固定過夜。次日加入RNA酶和PI染色液避光孵育15 min。最后流式細胞儀上機檢測，分析細胞周期變化情況。

1.3 統計分析

2 結 果

2.1 倒置顯微鏡觀察骨肉瘤HOS細胞活力

每2 d細胞換液時顯微鏡下觀察顯示HOS細胞活力良好，細胞呈集落生長，部分融合成片(見圖 1)。

2.2 Hoechst- 33258熒光染色觀察經不同濃度吳茱萸堿處理后骨肉瘤HOS細胞核的形態學變化

吳茱萸堿的不同藥物濃度(0、3、6、12 μmol/L)作用于人骨肉瘤HOS細胞48 h，熒光顯微鏡下對照組細胞胞核完整，著色均勻，熒光彌散而黯淡；不同濃度吳茱萸堿處理組細胞，染色質凝聚，細胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，著色不規則，呈現細胞凋亡核碎裂等典型變化，而且隨藥物劑量增加而更趨明顯(見圖2)。

圖1 倒置顯微鏡下培養48 h的骨肉瘤HOS細胞(A×100， B×200)

圖2 吳茱萸堿作用48 h后Hoechst- 33258熒光染色結果(×200) 注：A. 對照組；B. 3 μmol/L；C. 6 μmol/L；D. 12 μmol/L

2.3 流式細胞術檢測3 μmol/L吳茱萸堿處理后骨肉瘤HOS細胞的細胞周期變化

基于上述Hoechst- 33258熒光染色的結果，我們選用3 μmol/L的吳茱萸堿處理后骨肉瘤HOS細胞，利用周期檢測試劑盒對骨肉瘤HOS細胞進行染色。將未經吳茱萸堿處理的對照組細胞和給藥培養不同時間的樣品收集，PI單染后流式細胞儀上機檢測，各組的周期變化結果如下：G0/G1期：對照組(51.12±2.13)%，給藥組24 h(19.17±1.02)%、48 h(16.94±1.67)%、72 h(11.05±1.25)%，與對照組相比，72 h組(P=0.01、F=2.9)，差異有統計學意義；S期：對照組(32.92±0.73)%，給藥組24 h(31.00±3.42)%、48 h(32.38±3.03)%、72 h(29.18±2.87)%，與對照組相比，72 h組(P=0.024、F=15.46)，差異有統計學意義；G2/M期：對照組(16.01±2.26)%，給藥組24 h(49.82±0.62)%、48 h(50.67±2.80)%、72 h(59.56±1.97)%，與對照組相比，72 h組(P=0.1、F=1.32)，差異有統計學意義。分析上述結果發現：吳茱萸堿可誘導人骨肉瘤HOS細胞發生G2/M期阻滯，而S期變化不明顯。說明吳茱萸堿可以抑制骨肉瘤細胞的增殖能力，并阻滯細胞周期于G2/M期。(見圖3)

圖3 吳茱萸堿處理骨肉瘤HOS細胞周期變化注：A:人骨肉瘤HOS細胞流式細胞術檢測結果；B:流式細胞術檢測周期率統計圖， **P<0.01， ***P<0.001 vs Con，n=3

3 討 論

骨肉瘤作為一種來源于間葉組織的腫瘤，具有惡性程度高，臨床病情進展快，轉移早等特點，其好發于青少年長管狀骨的干骺端，例如股骨下端、脛骨上端，比例約為2/3。雖然目前采用手術加新輔助化療的方法，取得了較好的效果，術后五年生存率由之前的不足20%提高到了60%～70%，但治療中還是面臨許多新的問題，如化療耐藥，毒副作用等，特別是肺部及其他遠處轉移，患者預后極差，一般術后1～2年內死亡。因此，尋找或研發一種低副作用、無耐藥性、療效肯定的新型化療藥物來治療骨肉瘤成為臨床噬待解決的問題，而生物毒素近年來逐漸成為抗腫瘤藥物領域研究的熱點之一。

抗腫瘤藥物發揮抗腫瘤活性有很多種方式，可以通過細胞毒作用使細胞發生壞死，或者通過誘導細胞發生凋亡、阻滯細胞周期等方式發揮相應作用。吳茱萸堿是一種吲哚類生物堿，在多種腫瘤觀察到吳茱萸堿可誘導發生G2/M期阻滯，包括前列腺癌、乳腺癌等[13]。目前，腫瘤化療藥存在耐藥的情況，吳茱萸堿對人多重耐藥性腫瘤異種移植物的抗腫瘤活性優于紫杉醇。研究發現吳茱萸堿可以增加化療耐藥的乳腺癌細胞對阿霉素敏感性，而且對正常人外周血細胞幾乎沒有毒性[14]。由此可見吳茱萸堿有發展成為抗腫瘤藥物的潛力。

在我們的實驗中發現吳茱萸堿的不同藥物濃度(0、3、6、12 μmol/L)作用于人骨肉瘤HOS細胞48 h，熒光顯微鏡下對照組細胞胞核完整，著色均勻，熒光彌散而黯淡；不同濃度吳茱萸堿處理組細胞，染色質凝聚，細胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，著色不規則，呈現細胞凋亡核碎裂等典型變化，而且隨藥物劑量增加而更趨明顯。利用周期檢測試劑盒對HOS細胞進行染色。將未經吳茱萸堿處理的對照組細胞和給藥培養不同時間的樣品收集，PI單染后流式細胞儀上機檢測，各組的周期變化結果如下：G0/G1期：對照組(51.12±2.13)%、24 h(19.17±1.02)%、48 h(16.94±1.67)%、72 h(11.05±1.25)%；S期：對照組(32.92±0.73)%、24 h(31.00±31.42)%、48 h(32.38±3.03)%、72 h(29.18±2.87)%；G2/M期：對照組(16.01±2.26)%、24 h(49.82±0.62)%、48 h(50.6767±2.80)%、72 h(59.56±1.97)%。分析上述結果發現：吳茱萸堿可誘導人骨肉瘤HOS細胞發生G2/M期阻滯，而S期變化不明顯。說明吳茱萸堿可以抑制骨肉瘤細胞的增殖能力，并阻滯細胞周期于G2/M期。該實驗結果與Liao等人發現吳茱萸堿主要通過阻滯細胞周期于G2/M期發揮其抗腫瘤作用結果一致[13-15]

總而言之，我們發現吳茱萸堿可以抑制骨肉瘤細胞的增殖能力，而且隨藥物劑量增加而更趨明顯,并顯著阻滯細胞周期于G2/M期,為進一步研究吳茱萸堿抗骨肉瘤細胞作用奠定了前期基礎。