靈芝孢子粉對中重度慢性阻塞性肺疾病的隨訪研究

冼慧儀 馮曙平 陳 艷 吳 凡 李風雷

廣州醫科大學附屬第三醫院荔灣醫院(廣州 510000)

慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種持續進展性的氣道疾病，特征為廣泛氣流受限和氣道炎癥。COPD在中國的發病率逐年上升， 40歲以上人群的發病率由8.2%上升至13.7%[1- 2]。COPD疾病死亡率在世界疾病和死亡原因中排名第四，預計將在2020年升至第三大死亡原因[3]。該病的病因和發病機制尚不清楚。慢性氣道炎癥被認為是COPD發病機制中最重要的組成部分[4]。COPD的另一個病理特征是氣道黏膜和肺實質中的T淋巴細胞浸潤[5], 肺泡壁T細胞數量與肺組織損傷程度呈顯著正相關。COPD小鼠模型顯示肺實質中T細胞數量增加，且以CD8+T以及CD4+T 為主[6]。

靈芝包含400多種不同的生物活性化合物，其中主要有三萜、糖類(多聚糖和還原糖)、麥角甾醇類、類固醇、核酸類、脂肪酸、苯甲酸、生物堿、真菌溶菌酶、蛋白類化合物和微量元素等[7- 8]。靈芝孢子粉是靈芝的重要生物活性物質，具有調節血糖與血脂代謝、抑制腫瘤生長、提高免疫功能、減少肝損害、清除自由基、提高機體耐缺氧能力、保護心肌細胞和改善中樞神經系統等作用。T淋巴細胞是免疫執行功能中的主要炎癥細胞，巨噬細胞遞呈抗原后活化并發揮一系列作用。成熟的T淋巴細胞按照CD表型不同分為CD4+、CD8+兩大亞群。T細胞是體內發揮免疫作用的重要細胞，是機體免疫功能的承擔者和免疫反應的重要調節者，CD4+和CD8+淋巴細胞比例與氣道炎癥反應有著密切關系[9]。研究表明，與健康對照組比較，COPD患者的CD4+/CD8+水平與肺功能呈負相關[10]，T細胞亞群的失衡是導致COPD患者肺功能下降的原因之一[11]。COPD患者小氣道管壁、血管壁和肺實質中存在大量的CD8+T細胞數量的增多，并且發現CD4+/CD8+比例失調，CD4+/CD8+比例降低與COPD患者的肺功能下降密切相關[12- 13]。呼吸氣流受限程度及肺氣腫炎癥的嚴重程度與肺組織中CD8+T細胞的水平呈正相關，COPD的發病與機體免疫功能失衡存在聯系[14]。COPD中的慢性氣道炎癥伴隨著CD4+T細胞的表達降低，并且宿主識別外源性抗原的能力被削弱。這發生在長期升高的CD8+T細胞水平的背景下，降低了對肺組織的過度免疫損傷的修復能力。研究表明COPD小鼠中出現CD8+T細胞增加和CD4+T細胞的相應減少[15]。本研究中，旨在觀察靈芝孢子粉在中重度穩定期COPD患者癥狀評分，肺功能以及對患者外周血T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+水平的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

招募2017年7月—2018年2月收治的老年中重度COPD穩定期患者共19例，其中18例男性，1例女性；年齡57～76(68.2±6.0)歲。從不吸煙12人(63.2%)，目前吸煙6人(31.6%)，已戒煙1人(5.2%)。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①患者經影像學、臨床接觸、肺功能檢查等明確診斷為COPD，且病情相對穩定，符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2013年修訂版)制定的COPD診斷標準[1]；②臨床資料完整，且認知、溝通能力正常；③患者及家屬均簽訂了知情同意書。排除標準：①參與本研究前2個月內有過不穩定心絞痛、急性心肌梗死發作者；②合并氣胸、肺大皰以及行動障礙者，或無法完成肺功能檢測、6 MWT試驗者；③合并肺癌等呼吸系統疾病、血液系統疾病者；④精神病等特征人群。本研究通過倫理委員會批準。

1.3 研究方法

六分鐘步行試驗(6 MWT)[16]：指導患者以最快速的速度在30 m長的走廊上往返行走，一旦有明顯的胸悶頭暈、呼吸困難等癥狀，則立即停止實驗，并在實驗結束后檢測、記錄患者6 min內的步行距離；其中6 MWT試驗的分級標準如下：①輕度慢阻肺患者6 MWT試驗距離在350 m及以上；②中度慢阻肺患者6 MWT試驗距離在250～349 m；③重度慢阻肺患者6 MWT試驗距離是150～249 m；④極重度慢阻肺患者6 MWT試驗距離在149 m及以下。COPD評估測試(CAT)[17]：CAT測試方法主要用于評估慢阻肺對于患者生理健康的影響，包括有無胸悶、咳嗽、咳痰、氣喘等項目，每個項目評分在0～5分，總分是40分，其中輕度癥狀者評分是0～10分，中度癥狀者評分是11～20分，重度癥狀者評分是21～30分，極重度癥狀者評分是31～40分。⑤肺功能檢測：應用肺功能檢測儀，檢驗患者第一秒用力呼氣容積(FEV1)、用力肺活量(FVC)、第一秒用力呼氣容積占用力肺活量比值(FEV1/FVC)。

1.3.1 ①服用靈芝孢子粉膠囊(北京華恒漢方制藥有限公司)，3粒/次，每天3次；②比較本研究患者服用靈芝孢子粉前、后的6 MWT試驗的距離、CAT測試結果以及肺功能檢測指標；③應用流式細胞學檢測方法，評估CD4+、CD8+T所占外周血淋巴細胞比例及CD4+/CD8+比值檢測指標。

1.3.2 流式細胞學：儀器與試劑真空采血管為BD真空采血管內，內含EDTA-K2抗凝劑。淋巴細胞亞群:使用BD公司和Ebiolegned公司的抗體及BD公司鞘液進行檢測。抗體及標記熒光素分別為: CD4 FITC(BD公司)，CD8 APC-H7(BD公司)。儀器使用BD LSRFortessa流式細胞儀，檢測CD4+、CD8+細胞因子占外周血淋巴細胞中的比例以及CD4+/CD8+比值檢測。

1.4 統計學方法

2 結 果

納入患者的平均年齡為(68.20±6.0)歲，其中男性患者為18人(94.7%)，其中從不吸煙人數12人(63.2%)，正在吸煙人數6(31.6%)人，已戒煙人數1人(5.2%)；入選的患者肺功能均為GOLD分級3到4級。與服用靈芝孢子粉之前相比，服用靈芝孢子粉后患者的FEV1上升，在6個月時，靈芝孢子粉使用前后FEV1差異為 60 mL(圖1A)，但差異無統計學意義(1.17±0.25 vs 1.23±0.27，P=0.1888>0.05)；FVC差異為130 mL(圖1B)，FVC上升(2.32±0.52 vs 2.45±0.57，P=0.34<0.05)；FEV1/FVC差異為- 0.47(圖1C)，FEV1/FVC未見差異(51.78±10.92 vs 51.31±10.03，P=0.7707>0.05)。服用靈芝孢子粉后第2個月開始，患者FEV1、FVC和FEV1/FVC隨時間的變化呈平穩增加狀態(圖1D、圖1E、圖1F)。服用靈芝孢子粉6個月后患者的六分鐘步行距離延長，平均增加19 m(服藥后：490.89±35.85 vs 服藥前471.32±36.07，P<0.001)，患者的CAT評分也改善(服藥前12.3±3.5 vs 服藥后10.8±2.4，P<0.001)，但患者的mMRC呼吸困難等級評分無差異(0.8±0.7 vs 0.8±0.6，P=0.67>0.05)。見表1、圖2。

中重度COPD穩定期患者，服用靈芝孢子粉6個月后CD4+T細胞比例增加(服藥前21.25±8.41 vs 服藥后33.70±7.66，P=0.19<0.01)，CD8+T細胞比例有升高趨勢，但差異無統計學意義(服藥前19.66±8.90 vs 服藥后21.25±8.41，P=0.21>0.05)，但這提示靈芝孢子粉可提高中重度COPD穩定期患者CD4+T細胞比例。CD4+/CD8+T細胞比例無明顯變化(服藥前1.98±0.97 vs 服藥后1.87±0.91，P=0.58>0.05)。見圖3及表2。

圖1 服用靈芝孢子粉前、后患者FEV1、FVC和FEV1/FVC的變化。

表1肺功能指標和COPD評估指標

圖2 服用靈芝孢子粉前、后患者6分鐘步行試驗(6 minutes walking test，6 MWT)的變化(n=19)。

圖3 服用靈芝孢子粉前/后CD4+，CD8+以及CD4+/CD8+比值的變化情況(n=19)。A：CD4+T淋巴細胞亞群的散點圖；B：CD8+T淋巴細胞亞群散點圖；C：CD4+/CD8+比值散點圖。

表2 服用靈芝孢子粉前外周血T淋巴細胞亞群的變化情況(n=19)

3 討 論

COPD以不完全可逆性氣流受限為特征性疾病變，且氣流受限呈持續性發展，其病理改變表現為慢性支氣管炎和(或)阻塞性肺氣腫的病理變化。目前，COPD穩定期的治療方案主要包括戒煙、藥物治療、手術治療、機械通氣等。其中治療藥物主要包括支氣管擴張劑、吸入/口服糖皮質激素、炎癥介質拮抗劑及抗氧化劑等[18]。慢性吸入有毒顆粒和氣體會導致肺實質破壞，激活上皮細胞，增加黏液產生并刺激許多炎癥細胞的遷移[19]。這導致小氣道和肺泡中的異常炎癥反應，其中涉及許多炎性細胞，包括中性粒細胞，巨噬細胞和T淋巴細胞[20]。

近幾年來，伴隨國內人口老齡化加快，加上空氣霧霾等環境因素影響，COPD發生率、死亡率均呈現出升高趨勢，對患者生活質量造成不良影響，并帶來沉重的精神壓力和醫療負擔。研究表明，靈芝孢子粉可通過提高巨噬細胞產生腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的水平調節機體免疫的功能[21]。靈芝孢子粉能夠增強小鼠脾淋巴細胞的增殖能力，提高小鼠血清溶血素水平[22]，并且發現靈芝孢子油對免疫低下小鼠的固有免疫和非特異性免疫功能具有顯著調節作用[23]。靈芝孢子粉可提高外周血CD4+細胞、減少外周血CD8+細胞數量，升高CD4+/CD8+比例，并且增加外周血NK細胞數量，提示靈芝孢子粉能夠改善機體的細胞免疫功能[24]，我們的實驗結果也發現了類似的結果。

本研究結果發現，在服用靈芝孢子粉6個月后，中重度穩定期COPD患者服用靈芝孢子粉后FEV1較服用前增加60 mL(P>0.05)(圖A)，FVC增加為130 mL(P<0.01)(圖B)，FEV1/FVC比例降低0.47(P>0.05)(圖C)，說明患者的肺功能未見明顯下降，且較服藥前有輕度改善。服用靈芝孢子粉后患者FEV1、FVC和FEV1/FVC隨時間的變化呈平穩增加狀態，提示服用靈芝孢子粉在中重度穩定期COPD患者的肺功能存在一定的保護作用。6分鐘步行距離較服藥前增加19 m(P<0.001)，說明靈芝孢子粉對中、重度COPD穩定期患者治療干預的療效有所改善。

在COPD的發病機理中鑒定了不同的T細胞亞群，氣道和肺實質中CD8+T細胞比CD4+T細胞在疾病進展過程中起到更為重要的作用[25]。COPD的許多研究都集中在免疫系統在肺部的作用。顯示T淋巴細胞廣泛存在于COPD患者的肺泡壁中，并且肺內淋巴細胞浸潤的程度與疾病嚴重程度相關[26]。長期以來已經確定CD8+細胞在COPD的病原體中起主要作用，并且這些細胞大量存在于患者的氣道中[27]。然而，與肺部炎癥成分相比，對COPD中循環淋巴細胞的特征和功能知之甚少。我們的研究結果發現，服用靈芝孢子粉6個月后，中重度COPD穩定期患者CD4+T細胞比例顯著增加(P<0.01)，CD8+T細胞比例無明顯變化(P>0.05)，CD4+/CD8+T細胞比例無明顯變化(P>0.05)，表明服藥后患者的免疫調節狀態良好，未出現明顯的T細胞亞群比例改變。

本研究也存在以下不足：①觀察周期較短：本研究的隨訪周期只有6個月，對于其用藥后遠期表現未做觀察；②樣本量不足：某些觀察指標會由于樣本量的不足導致統計學上的強度不夠。

總之，我們的研究提供了靈芝孢子粉對穩定期COPD患者的在CAT評分及6 MWT步行距離上起著保護作用，這對于緩解中重度COPD患者的癥狀提供了非常重要的干預方式，為后續預防肺功能下降和改善穩定期COPD生活質量提供良好的研究基礎。