融合基因陽性急性B淋巴細胞白血病患兒免疫表型分析

張 霞 劉新剛 徐 剛 覃文琪 李阿麗 鄭衛東

1 深圳大學總醫院檢驗科(深圳 518055) 2 深圳市兒童醫院檢驗科(深圳 518000)

急性B淋巴細胞白血病(acute B-lymphoblastic leukemia，B-ALL)發病率約占急性淋巴細胞白血病的85%，是兒童時期最為常見的腫瘤[1- 2]。B-ALL的診療有賴于MICM的分型(即細胞形態學、免疫學、細胞遺傳學和分子生物學)。在免疫學方面，惡性腫瘤細胞抗原的表達具有高度的異質性，其診斷依賴于白血病相關免疫表型[3]；在細胞遺傳學及分子生物學方面，白血病存在著染色體數目及結構異常，可產生新的融合基因。表達融合基因的B-ALL是否存在特征性的免疫表型的改變并不清楚。本研究通過分析常見融合基因陽性的B-ALL患兒免疫表型特征，探討融合基因的表達與免疫表型之間的關系，有助于提高融合基因結果判讀的準確率及進一步研究B-ALL的發病機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2016年10月—2018年12月在深圳市兒童醫院診斷及治療的B-ALL患兒共120例。所有患者均依據MICM標準(即具備細胞形態學、免疫分型、細胞遺傳學及分子生物學結果)明確診斷[4]?；純撼踉\時均應用流式細胞術分析免疫表型特性及多重巢式RT-PCR檢測融合基因表達。本研究已通過醫學倫理委員會批準，得到患兒及家屬同意。

1.2 流式細胞術檢測

采用肝素抗凝管抽取患者2～4 mL骨髓標本，24 h檢測。骨髓標本通過細胞計數后，取(1～2)×105個有核細胞于流式測定管中。所用的單克隆抗體包括BD Horizon V500標記的CD45、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、別藻青蛋白(allophycocyanin，APC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、多甲藻葉綠素蛋白(peridinin chlorophyll protein，Percp)、PerCP-Cy5.5、PE-CY7、APC-Cy7、BD Horizon V450標記的淋系相關抗原(CD19、CD10、CD20、CD22、CD9、CyCD79a、CD58、SmIgM、CyIgM、TdT、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CyCD3)，髓系及干/祖細胞系相關抗原(CD13、CD64、CD14、CD15、CD33、CD117、CD11b、CD34、CD38、HLA-DR、CD123)及同型對照IgG等。以上抗體購自美國Becton Dickinson公司及Beckman Coulter公司。流式管中加入抗凝標本后根據試劑說明書加入抗體，充分混勻后，室溫(18℃～25℃)下避光孵育15 min；加入溶血素充分混勻，避光放置10 min，1 300 r/min離心5 min，棄去上清液；加入磷酸鹽緩沖液(PBS)充分混勻，以300 g離心5 min，棄去上清液；加入500 μL PBS混勻后用FACS Canto II流式細胞分析儀(BD公司，美國)進行檢測。應用FACS Diva Version 7.0軟件進行樣本分析。初診時免疫分型至少記錄1×104個有核細胞。胞漿或胞核抗原表達陽性率≥10%為陽性，其他抗原表達陽性率≥20%定義為陽性。

1.3 43種融合基因檢測

采用EDTA-K2抗凝管抽取患者2～4 mL骨髓標本，分離患者骨髓的單個核細胞，應用Trizol Reagent提取總RNA，并通過微量紫外分光光度儀測定RNA濃度及純度。按照試劑盒說明書要求配置cDNA反應液進行逆轉錄反應，然后在裝有相應PCR預混液的PCR管中加入上述cDNA液5 μL，總反應體系25 μL，應用ABI 7500儀進行PCR擴增，擴增條件：預變性42℃，5 min，95℃，10 min；PCR循環：(94℃，15 s；60℃，60 s)40個循環,在PCR循環第二步60℃時收集熒光信號。按照說明書進行BCR-ABL、TEL-AMLl、E2 A-PBX1、MLL-(MLL，AF4，AF6，AF9，AF10，ENL，AF17，AF1q，AF1p，ELL，SEPT6)、TEL-JAK2、AML1-ETO、CBFβ-MYH11、FIP1 L1-PDGFRA、DEK-CAN、AML1-MDS1/EVI1、AML1-MTG16、NPM-MLF、SIL-TAL1、SET-TAL1、SET-CAN、TEL-PDGFRB、TLS-ERG、NUP98-(HoxA11、HoxA11、HoxD13、HoxA9)，(NPM，FIP1 L1，STAT5 b，PML，PLZF)-RARα和TEL-ABL結果判定。

1.4 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析，計數資料(CD抗原陽性率、男女比例等)比較采用Person卡方檢驗及Fisher精確檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 5種常見融合基因的表達情況

120例B-ALL患兒檢測到融合基因陽性共45例，總檢出率為37.5%，包括TEL/AML1、E2 A/PBX1、BCR/ABL1、MLL、TLS/ERG 5種融合基因，分別為27例、7例、6例、4例、1例，各占60.0%、15.6%、13.3%、8.9%、2.2%，其中MLL相關的伙伴基因共檢出3種，分別為：MLL/AF4(2例)、MLL/AF10(1例)、MLL/ENL(1例)。

2.2 融合基因陽性的B-ALL患兒性別及年齡分布情況

TEL/AML1、E2 A/PBX1及BCR/ABL1融合基因陽性組在1～10歲兒童患者中占比最高，其陽性率分別為：96.3%(26/27)、85.7%(6/7)、83.3%(5/6)；MLL基因陽性的B-ALL主要發生在1歲以下兒童，其陽性率為75%(3/4)；TLS/ERG融合基因陽性發生在1例1歲5個月的患兒。各融合基因陽性組及陰性組患兒不同年齡段分布差異有統計學意義(P<0.01)，性別分布差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1融合基因陽性的B-ALL患兒性別及年齡構成情況

2.3 融合基因陽性的B-ALL患兒免疫表型特征

各融合基因陽性組CD19陽性率為100%；27例TEL/AML1陽性表達患者中，21例為普通-B-ALL表型，6例為前-B-ALL表型，干/祖細胞抗原CD34的陽性率為81.5%(22/27)；7例E2 A/PBX1陽性表達患者中，6例為前-B-ALL表型，1例為成熟-B-ALL表型，不表達CD34；6例BCR/ABL1陽性表達患者中，3例為普通-B-ALL表型，2例為前-B-ALL表型，1例為成熟-B-ALL表型，CD34陽性率為100%；4例MLL陽性患者表達的B-ALL抗原有CD22(100%)、CyCD79 a(75%)、CD10(50%)、CD9(50%)、CyIgM(50%)；各融合基因陽性組B-ALL均不表達T系抗原CD3、CD4、CD5和CD8，1例MLL基因陽性B-ALL患兒表達CD2和CD7；各組融合基因陽性B-ALL髓系抗原表達以CD33、CD13、CD66c最常見，在TEL/AML1陽性組中CD33和CD13陽性率分別為74.1%(20/27)、33.3%(9/27)，BCR/ABL1陽性組以CD66 c陽性率最高，為100%(6/6)，其次為CD33，陽性率為66.7%(4/6)，各基因陽性組不表達髓系抗原CD117、CD64、CD14、cMPO、CD11 b；E2 A/PBX1陽性組不表達已知的T系及髓系抗原。見表2。

表2融合基因陽性的B-ALL患兒抗原表達情況[n(%)]

2.4 融合基因陽性的B-ALL患兒髓系抗原表達比較

6例BCR/ABL1陽性表達患者均表達髓系抗原，27例TEL/AML1陽性組髓系抗原表達陽性率為74.1%，7例E2 A/PBX1陽性表達患者不表達髓系抗原，各融合基因陽性組及陰性組患兒髓系抗原陽性率比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3融合基因陽性的B-ALL患兒髓系抗原表達構成情況[n(%)]

3 討 論

ALL是兒童惡性腫瘤中最常見的類型，隨著白血病診斷技術的不斷提高及化療方案的改進，如今兒童的10年總生存率可達到(76.5±1.5)%[5]。兒童ALL療效的顯著提高主要依賴于疾病早期進行MICM分型及個體化治療[6]，表達特殊免疫表型及融合基因與ALL患兒預后關系密切，可為臨床危險度分級及個體化治療提供依據[7]。本研究對120例患兒進行43種融合基因檢測，共檢出5種常見的融合基因，包括：TEL/AML1、E2 A/PBX1、BCR/ABL1、MLL/(AF4，AF10，ENL)、TLS/ERG，總檢出率為37.5%，高于趙莉[8]等報道的陽性率(30%，15/50)，可能與統計的患兒例數差異有關。

TEL/AML1融合基因與染色體t(12；21)易位相關，是B-ALL患兒預后良好的指標之一[9]。本研究顯示，5種常見融合基因中TEL/AML1陽性率最高，占B-ALL患兒總例數的22.5%，與張建平[10]等研究結果一致。既往研究顯示[11]，TEL/AML1融合基因陽性B-ALL以普通-B-ALL和前-B-ALL表型為主，早前-B-ALL和成熟-B-ALL表型極少見，本研究27例TEL/AML1融合基因陽性患兒中21例為普通-B-ALL表型，6例為前-B-ALL表型，與報道相符。E2 A/PBX1融合基因與染色體t(1；19)易位相關，在兒童ALL中占3%～5%，主要發生在年齡偏大的兒童。本研究7例E2 A/PBX1陽性患兒均缺乏CD34的表達，以前-B-ALL表型為主，這與唐燕萍[12]等報道一致。BCR/ABL1融合基因系t(9；22)易位所致，其發生率與年齡顯著相關，在B-ALL中以成人多見。本研究表達BCR/ABL1融合基因的陽性率為5%，遠低于成人的20%～25%。在免疫表型方面，本研究6例BCR/ABL1陽性患兒均表達CD34，CD34是目前研究較多的一個干/祖細胞抗原，主要表達于分化較差的白血病亞型[13]， CD34的高表達可能是影響BCR/ABL1陽性患兒治療效果不良的因素之一。MLL基因重排發生于11 q23染色體，以1歲以內嬰幼兒為主，通常為早前-B-ALL表型，伴MLL基因重排的白血病患兒預后差。本研究中MLL組可表達T系相關抗原CD2、CD7，白血病相關抗原異質性更明顯，可能與預后不良有關。TLS/ERG融合基因是一種少見的特異性染色體重排，陽性患者預后不良[14]。既往報道[15]，TLS/ERG融合基因表現為前-B-ALL表型，唐艷萍[12]等研究顯示，TLS/ERG融合基因除前-B-ALL表型外，還可有早前-B-ALL和普通-B-ALL表型，本研究中1例TLS/ERG融合基因陽性患兒為普通-B-ALL表型。

本研究在對5種常見融合基因是否表達髓系抗原的分析中發現，E2 A/PBX1陽性組不表達髓系抗原，其他組均有不同程度的陽性率，以BCR/ABL1組陽性率最高(100%)，其次為TEL/AML1組(74.1%)。TEL/AML1組髓系抗原以CD33(74.1%)、CD13(33.3%)為主，CD66 c表達僅7.4%，BCR/ABL1組髓系抗原以CD66 c(100%)、CD33(66.7%)為主，其次為CD33(33.3%)，兩者髓系抗原分布特征明顯。以往研究有部分學者認為伴髓系抗原的ALL預后差[16]，大多數觀點又認為髓系抗原表達與疾病預后無相關。本研究根據報道的5種常見融合基因預后可推測髓系抗原表達陽性率高低與疾病預后無相關，可能與特殊的CD分子表達相關。在CD34表達方面，TEL/AML1組與TLS/ERG5組不表達CD34，與其他組比較差異有統計學意義。MLL組可表達T系相關抗原，其他融合基因組均不表達，可用于表達MLL融合基因的預測。

綜上所述，表達融合基因的急性B-ALL患兒的年齡構成及免疫表型中具有一定的分布特點，其特征性免疫表型的改變可用于初診時融合基因表達的預測，提高融合基因結果判讀的準確率。本研究不足之處在于融合基因陽性例數較少，有待以后擴大樣本總量積累更多的陽性例數再做進一步的研究。