蒜氨酸對血管性癡呆大鼠腦損傷的作用及機制研究

劉 景 張月月

1 惠州市第一人民醫院藥學部(惠州 516000) 2 遵義醫科大學珠海校區(珠海 519000)

血管性癡呆(Vascular dementia, VD)是由各種腦血管疾病引起的以認知功能障礙為表現的一種臨床綜合癥。近年來，VD發病率逐年上升，僅次于阿爾茨海默病成為世界上第二大癡呆常見類型[1]。目前，對于VD治療尚無特效藥。蒜氨酸是大蒜中的主要有效成分，化學名為S-烯丙基半胱氨酸亞砜(SAC)，趙立、HUI等[2- 3]研究發現蒜氨酸具有抗氧化、清除自由基、抗炎癥及保護心血管等多種作用。本研究主要觀察蒜氨酸對血管性癡呆(VD)腦損傷的作用，并探討其可能的作用機制，為其應用于臨床提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

動物：SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄各半，體質量在200～250 g，購自第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心，許可證號為SCXK(渝)2016-5。所有大鼠均遵循實驗動物倫理學要求進行飼養及實驗操作。

試劑：蒜氨酸(本實驗室自己提取，純度大于94%)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(英國Abcam公司)，iNOS兔抗大鼠多克隆抗體(英國Abcam公司)，IL-1β兔抗大鼠多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，TNF-α兔抗大鼠多克隆抗體(武漢BOSTER公司)，β-actin小鼠抗大鼠多克隆抗體(江蘇碧云天生物技術研究所)。

主要儀器：MT- 200 Morris水迷宮購自成都泰盟科技有限公司，i-mark酶標儀及全自動凝膠圖象分析儀均購自美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、造模與給藥方法

采用隨機數字表法將40只大鼠分為假手術組、模型組、蒜氨酸低、中、高劑量組，每組大鼠為8只。模型組和蒜氨酸組采用雙側頸總動脈結扎建立VD大鼠模型，具體方法如下：造模前12 h每組大鼠開始禁食，正常飲水，各組大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射進行麻醉，麻醉成功后立即分離迷走神經及頸總動脈，用雙重絲線結扎雙側頸總動脈。假手術組只分離頸總動脈，但不做結扎。造模7 d后蒜氨酸組分別給予蒜氨酸10、20、30 mg/kg灌胃治療，假手術組和模型組給予等量生理鹽水灌胃治療，每組均為1次/d，共4周。

1.2.2 Morris水迷宮行為檢測

各組動物灌胃4周后，進行Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力。水池直徑140 cm，高40 cm，水深35 cm，水溫(24±2)℃。在目標象限中放置一個平臺，直徑11 cm，高26 cm，沒于水下1 cm。實驗總共6天，前5天進行定位航行實驗，每天訓練4次，每次入水點可以不同，平臺位置不變，每次記錄大鼠尋找到平臺的時間。第6天進行空間探索實驗，撤去平臺，記錄60s內找到平臺次數。

1.2.3 大鼠海馬組織SOD活性檢測

水迷宮實驗后，各組大鼠隨機選取4只用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射進行麻醉，麻醉后斷頭取腦，分離海馬組織，加入裂解液進行勻漿，然后離心取上清液。采用ELISA法檢測大鼠海馬超氧化物歧化酶(SOD)活性，所有操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 Western blotting檢測大鼠海馬iNOS、IL-1β及TNF-α蛋白的表達

水迷宮實驗后，各組大鼠的另外4只用水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后，斷頭取腦，分離海馬組織，勻漿，4℃，12 000 rpm，離心10 min，然后取上清液，用BCA法測定待測樣品的蛋白濃度。配膠、上樣，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離蛋白，然后將分離的蛋白轉移到PVDF膜上。將一抗加入裝有PVDF膜的塑料膜袋中，4℃孵育過夜，取出在室溫加入二抗孵育90 min。然后使用ECL化學發光法用BIO-RAD凝膠成像儀進行曝光，后將膠片進行掃描，采用Quantity One定量分析軟件系統對圖像進行灰度分析。

1.2.5 統計學處理

2 結 果

2.1 蒜氨酸對血管性癡呆大鼠學習記憶的影響

Morris水迷宮結果表明，與假手術組比較，模型組在定位航行實驗中逃避潛伏期延長(P<0.05)，在空間探索實驗中找到平臺次數也減少(P<0.05)。蒜氨酸各劑量組與模型組比較逃避潛伏期縮短(P<0.05)，找到平臺次數增加(P<0.05)。第一天假手術組與模型組比較P=0.015，F=7.706；第二天假手術組與模型組比較P=0.004，F=11.767；第三天假手術組與模型組比較P=0.021，F=6.792；第四天假手術組與模型組比較P=0.006，F=10.551；第五天假手術組與模型組比較P<0.001，F=22.379；第六天假手術組與模型組空間探索實驗比較P=0.001，Z=- 3.371；第一天蒜氨酸高劑量組與模型組比較P=0.034，F=5.553；第二天蒜氨酸高劑量組與模型組比較P=0.012，F=8.239；第三天蒜氨酸高劑量組與模型組比較P=0.037，F=5.342；第四天蒜氨酸高劑量組與模型組比較P=0.022，F=6.667；第五天蒜氨酸高劑量組組與模型組比較P=0.003，F=12.389；第六天蒜氨酸高劑量組與模型組空間探索實驗比較P=0.001，Z=- 3.184；第一天蒜氨酸中劑量組與模型組比較P=0.048，F=4.682；第二天蒜氨酸中劑量組與模型組比較P=0.041，F=5.084；第三天蒜氨酸中劑量組與模型組比較P=0.047，F=4.738；第五天蒜氨酸中劑量組組與模型組比較P=0.033，F=5.608；第六天蒜氨酸中劑量組與模型組空間探索實驗比較P=0.008，Z=- 2.659；第六天蒜氨酸低劑量組與模型組空間探索實驗比較P=0.008，Z=- 2.659。見表1。

表1水迷宮測試蒜氨酸對血管性癡呆大鼠學習記憶的影響

注：*P<0.05與模型組比較；#P<0.05， 與假手術組比較

2.2 蒜氨酸對血管性癡呆大鼠海馬SOD含量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠海馬SOD含量下降，差異有統計學意義(P<0.001，F=127.608)；蒜氨酸高劑量組與模型組比較，大鼠海馬SOD含量升高，差異有統計學意義(P<0.001，F=67.5)；蒜氨酸中劑量組與模型組比較，大鼠海馬SOD含量升高，差異有統計學意義(P<0.001，F=47.44)；蒜氨酸低劑量組與模型組比較，大鼠海馬SOD含量升高，差異有統計學意義(P=0.047，F=6.237)。見表2。

組別SOD(U/mg)假手術組8.76±0.053模型組3.75±1.23##蒜氨酸低劑量組4.48±1.10*蒜氨酸中劑量組6.15±1.27**蒜氨酸高劑量組6.65±0.95**

注：**P<0.01 與模型組比較；*P<0.05 與模型組比較；##P<0.01 與假手術組比較

圖1 蒜氨酸對iNOS、IL-1β及TNF-α蛋白表達的影響

2.3 蒜氨酸對大鼠海馬iNOS、IL-1β及TNF-α蛋白表達的影響

采用Western blotting檢測了大鼠海馬iNOS、IL-1β及TNF-α的蛋白表達。結果顯示：與假手術組比較，模型組iNOS、IL-1β及TNF-α蛋白表達升高；蒜氨酸各劑量組與模型組比較，iNOS、IL-1β及TNF-α蛋白的表達降低(P<0.05)(見圖1)。

3 討 論

血管性癡呆(Vascular dementia, VD)的發病機制至今尚未完全明確，但多數學者認為氧化應激和炎癥反應是VD發病的不可忽視的重要環節[4- 5]。VD患者血液中氧自由基如NO、iNOS等增多，而相應的氧化應激標志物SOD等體內清除自由基的關鍵酶減少。Zhang等[6]研究發現VD大鼠海馬組織內 TNF-α 和 IL-1水平增高，且神經元形態異常，認知能力下降，且有研究報道，VD患者腦內iNOS、IL-1β及TNF-α水平高于非VD患者[7]。Luo等[8]發現抑制VD大鼠海馬區小膠質細胞活化，能使iNOS、IL-1及TNF-α 降低，并能減輕海馬神經元損傷。由上可提示，炎癥相關因子增多可能會引起神經元損傷或死亡， 進一步影響認知功能，最終導致VD的發生。

蒜氨酸是大蒜中的主要有效成分，化學名為S-烯丙基半胱氨酸亞砜(SAC)。有研究報道，蒜氨酸具有抗炎、抗氧化及清除自由基等作用[2- 3]，本研究主要是觀察蒜氨酸對VD大鼠腦損傷的作用及其可能的作用機制。在Morris水迷宮實驗中發現蒜氨酸給藥組的大鼠在定位航行實驗中逃避潛伏期縮短，空間探索時尋找到平臺次數增加，提示蒜氨酸可改善VD大鼠學習記憶能力。

氧化應激在VD的發生發展中起重要的作用，當大腦發生缺血性損傷時，NO和 iNOS 急劇增加，NO具有潛在的神經毒性，可通過與氧自由基相互反應生成有毒性的強氧化劑，最終導致神經元壞死或凋亡[9]。iNOS是NO生成過程中重要的限速酶，能夠持續催化NO產生，其過度表達會促進神經元進一步的損傷[10]。SOD是清除氧自由基的重要的超氧化物歧化酶，可以減少氧化應激損傷，因此它在大腦損傷時會因消耗增加而活力下降。本研究發現模型組大鼠海馬SOD含量下降，iNOS蛋白表達增高，而蒜氨酸給藥組與模型組比較，大鼠海馬SOD含量升高，iNOS蛋白表達下降，提示蒜氨酸可能通過調節自由基代謝，提高抗氧化劑活力，降低炎癥相關酶類的表達，從而減輕腦神經損傷。

有研究[11-12]顯示，炎癥在VD發生發展過程中起重要作用。炎癥可刺激小膠質細胞使其活化后分泌大量IL-1β、TNF-α等引起神經元損傷，IL-1β、TNF-α等升高可損害認知功能[13]，進一步導致VD的發生。TNF-α能使細胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1等增加，從而破壞血腦屏障的功能[14]。另外促炎因子IL-1β及TNF-α等還可促使神經細胞產生iNOS，進一步加重神經元損害。有報道[15]顯示IL-1β及TNF-α等促炎因子可能通過直接損害膽堿能細胞而導致Ach合成減少，從而破壞膽堿能系統，最終導致VD的發生。本研究顯示模型組IL-1β及TNF-α蛋白表達升高，蒜氨酸給藥組與模型組比較，IL-1β及TNF-α蛋白的表達降低，提示蒜氨酸可能通過抑制IL-1β及TNF-α炎癥因子的產生，從而減輕腦組織損傷。VD的發生發展機制相當復雜，蒜氨酸對于VD的治療作用仍有待進一步研究。