維生素B族復(fù)合TRP肽和SOD對焦慮性抑郁癥C57BL/6小鼠行為學(xué)改善的影響

朱西平 - 李文治 - 陶 倩 何文江 - 崔 春,3 ,3

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.無限極﹝中國﹞有限公司，廣東 江門 529156；3.廣東巍微生物科技有限公司，廣東 廣州 510641)

試驗擬研究維生素B族復(fù)合TRP肽和SOD配方(VB3∶VB6∶TRP肽∶SOD=2∶10∶3∶4)潛在的改善和預(yù)防焦慮性抑郁癥的作用，為維生素B族復(fù)合TRP肽和SOD配方在醫(yī)藥、保健品方面應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗動物

C57BL/6小鼠：4周齡，(18±2)g，常州凱文斯動物實驗有限公司。小鼠購入后先適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，試驗期間小鼠均在室溫(24±2)℃、相對濕度(50±5)%、光/暗周期12 h/12 h的環(huán)境下喂養(yǎng)，并按試驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 材料與試劑

皮質(zhì)酮(CORT)：北京索萊寶科技有限公司；

VB6、VB3和SOD：食品級，純度≥95%，深圳中科欣揚生物科技有限公司；

TRP肽：食品級，純度≥95%，無限極中國有限公司；

氟西汀分散片(百憂解)：禮來蘇州制藥有限公司；

生化試劑盒購：江萊生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

小鼠高架十字迷宮視頻分析測試系統(tǒng)：XR-XG201型，上海軟隆科技發(fā)展有限公司；

小鼠曠場視頻分析測試系統(tǒng)：XR-XZ301型，上海軟隆科技發(fā)展有限公司；

小鼠強迫游泳視頻測試分析系統(tǒng)：SA2091型，上海軟隆科技發(fā)展有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：FilterMax F3/F5型，美國Molecular Devices公司；

電子天平：FA2204B型，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 焦慮性抑郁癥動物模型建立 84只雄性C57BL/6小鼠在濕度(60±10)%和溫度(25±2)℃條件下飼養(yǎng)(每籠5只；320 mm×215 mm×170 mm)，標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件下，晝夜交替12 h，隨意獲取正常食物和水，在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心進行試驗。試驗方案經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗中心委員會批準(zhǔn)，并遵循中國試驗動物護理和使用指南。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d開始造模，造模方法根據(jù)Zhu等[2]報道的方法進行。將小鼠隨機分配到7個試驗組(n=12)并每周稱重。5組受到慢性束縛應(yīng)激(Chronic restraint stress，CRS)(6 h/d，9:00～15:00)，然后皮下注射皮質(zhì)酮(CORT)溶解于含有0.1%二甲基亞砜(DMSO)和0.1% Tween-80的生理鹽水中[劑量30 mg/(kg·d)]。溶媒對照組(VG)給予CRS(6 h/d，9:00～15:00)，并以0.02 mL/g體重的體積皮下給予生理鹽水。將正常對照(NC)小鼠禁食(6 h/d，9:00～15:00)，并以0.02 mL/g體重的體積皮下給予生理鹽水。連續(xù)造模21 d后，5組受到慢性束縛應(yīng)激，然后皮下注射皮質(zhì)酮的小鼠均表現(xiàn)出不同程度的焦慮和抑郁樣行為，然后將這5組焦慮和抑郁樣行為的小鼠隨機分配到不同的治療組。NC為生理鹽水治療的正常對照組；VG為生理鹽水治療用溶媒對照組；PC為鹽酸氟西汀治療陽性對照組(98%)，18 mg/(kg·d)；MC為用生理鹽水治療的模型對照組；VBPSH、VBPSM、VBPSL分別為高、中、低劑量維生素B族復(fù)合TRP肽和SOD配方治療組，260，195，130 mg/(g·d)。將所有治療劑溶解在上述鹽水中，每只小鼠體積為10 mL/(kg·d)。

1.2.2 強迫游泳試驗 在建模后(第4周)和治療4周后(第8周)，在白天對所有小鼠進行動物強迫游泳行為試驗。在整個測試過程中，為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果必須確保小鼠行為學(xué)試驗在一個安靜和平穩(wěn)的環(huán)境下進行，且整個試驗過程中保持溫度為(25±1)℃。根據(jù)Poleszak等[18]報道的方法，該測試在2 d內(nèi)進行兩次。第一階段測試：將每只小鼠單獨輕輕放入裝有水(水位高度15 cm)的玻璃圓筒(Φ10 cm×25 cm)，使每只試驗小鼠適應(yīng)游泳6 min。第二階段測試：適應(yīng)游泳結(jié)束24 h后，開始第二階段的試驗，總共6 min。其中將動物放入圓筒中并使其適應(yīng)游泳1 min；然后開始一個5 min的測試，測試過程中使用數(shù)碼攝像系統(tǒng)跟蹤和記錄動物的運動和行為，測量不動的總持續(xù)時間(s)。游泳不動標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)試驗小鼠浮動時，僅用一只腳輕輕劃動或稍微移動，以保持其頭部高于水，而不掙扎。試驗結(jié)束后，立即將小鼠從水中取出并放回飼養(yǎng)籠。

1.2.3 曠場試驗 試驗設(shè)備為方形盒(40 cm長×40 cm寬×40 cm高)，材料為白色聚氯乙烯。試驗根據(jù)朱明好等[19]的方法進行并有所改進，每次試驗之前或者兩次測試之間用70%乙醇水溶液徹底清洗實驗設(shè)備并使其干燥，以消除前一次測試留下的尿液和糞便氣味的影響。在整個測試過程中，為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果必須確保小鼠行為學(xué)試驗在一個安靜和平穩(wěn)的環(huán)境下進行。該測試還包括兩個階段：預(yù)測試，其中將動物輕輕放置在盒子的最右上角并允許適應(yīng)15 min；在預(yù)測試結(jié)束24 h后進行10 min 的測試，其中每只小鼠再次單獨放置在盒子的最右上角并允許自由移動，其運動和行為也使用數(shù)字攝像系統(tǒng)記錄。在試驗結(jié)束后，立即將小鼠從盒子中取出并放回飼養(yǎng)籠。對視頻進行分析，將箱底板分成16個相等尺寸(10 cm×10 cm)的小方塊，記錄每只小鼠在每個小方塊中花費的時間。按式(1)計算中央停留時間百分比。

(1)

式中：

c——中央停留時間百分比，%；

m1——曠場試驗中央?yún)^(qū)域停留時間，s；

m2——曠場試驗總測試時間，s。

1.2.4 高架十字迷宮試驗 根據(jù)Walf等[20]的方法略有修改，在曠場試驗結(jié)束2 d后進行高架十字迷宮試驗。迷宮由一個十字形平臺組成，有兩個開放式臂(長30 cm×寬5 cm)和兩個閉合臂(30 cm長×5 cm寬×15 cm深)，兩個臂有一個共同的中心區(qū)(5 cm長× 5 cm寬)，測試時整個迷宮被抬高到距離地面80 cm的高度。同樣，在整個測試過程中，為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果必須確保小鼠行為學(xué)試驗在一個安靜和平穩(wěn)的環(huán)境下進行。將每只小鼠單獨放置在面向其中一個開臂的迷宮中心上，適應(yīng)1 min后并用數(shù)碼攝像系統(tǒng)記錄其5 min運動和行為。對于視頻分析，記錄了開臂進入次數(shù)和開臂停留時間百分比。每次試驗之前或者兩次測試之間用70%乙醇水溶液徹底清洗試驗設(shè)備并使其干燥，以消除前一次測試留下的尿液和糞便氣味的影響

1.2.5 小鼠體重和生化指標(biāo)測定 小鼠體重從適應(yīng)性喂養(yǎng)1周開始，以后每周測定一次小鼠體重并記錄數(shù)據(jù)，建模與灌胃期間共7周，收集3次體重數(shù)據(jù)進行分析，分別是初始體重、建模后體重和治療后體重。初始體重為適應(yīng)性喂養(yǎng)第1周體重；建模后體重為第4周體重；治療后體重為第8周體重。計算小鼠不同處理時期體重變化指數(shù)。行為學(xué)試驗測試24 h后，所有試驗小鼠用4%水合氯醛(腹腔注射0.1 mL/10 g)深度麻醉，并通過眼球摘除取血和脊柱脫位處死。首先，將摘除眼球的小鼠的血液立即收集到含有EDTA的2.0 mL離心管中，在(25±1)℃ 下保持30 min，并在3 000×g和4 ℃下離心15 min 以收集上清液(血清)。根據(jù)試劑盒說明書，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和比色法測定血清TNF-α，IL-6，IL-1β和IFN-γ水平。眼球取血后，在冰上快速取下海馬和下丘腦，用冰冷的生理鹽水溶液沖洗，用吸水紙吸水后，再加入9倍體積的PBS(pH 7.4)后，用均質(zhì)儀將樣品勻漿，然后在4 ℃(3 000×g，20 min)下離心取上清。根據(jù)試劑盒說明書，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和比色法測定上清液中TRP、KYN、NAD+、KYNA和MDA的含量，以及SOD、CAT、NOS的活性。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用 SPSS 17.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，所有試驗均重復(fù)3次。采用Duncan’s post-hoc檢測對各數(shù)據(jù)間的平均值進行差異顯著性分析，并對各組數(shù)據(jù)平均值顯著性差異進行評價(P<0.05)。數(shù)據(jù)表述采用(平均值±方差)的形式。

2 結(jié)果與討論

2.1 VBPS配方對小鼠日常活動和體重的影響

在整個試驗過程中，NC小鼠在行為方面表現(xiàn)正常，包括進食、飲水、運動、排便和排尿均表現(xiàn)正常狀態(tài)，而MC小鼠則表現(xiàn)出無精打采，體重增加緩慢，運動緩慢，進食和飲水減少等癥狀。在造模期間(0～3周)，受CRS和CORT誘導(dǎo)應(yīng)激的小鼠均表現(xiàn)出無精打采，體重增加緩慢，運動緩慢，飲食和飲水減少。在給藥期(4～7周)后，觀察到治療小鼠的焦慮性抑郁行為得到改善，包括體重增加，進食和飲水增加。在建模過程中，NC(5.64 g)和VG(3.46 g)小鼠的體重增加指數(shù)顯著高于造模小鼠(MC、PC、VBPSH、VBPSM和VBPSL)，且造模組之間的體重增加指數(shù)[(1.59±0.13)g]沒有顯著性(P>0.05)的差異(圖1)。灌胃處理4周后，與正常組比較，MC組(焦慮性抑郁癥未治療組)體重增加指數(shù)顯著減少(P<0.05)；與模型組相比，各處理組小鼠體重增加指數(shù)均明顯高于(P<0.05)MC處理組小鼠。陽性對照組(PC)和VBPSH處理組體重增加指數(shù)最為明顯，其次為VBPSM和VBPSL處理組。綜上所述，VBPS處理可改善焦慮性抑郁癥小鼠體重增加緩慢的癥狀。

圖1 VBPS處理對小鼠體重增加指數(shù)的影響

2.2 VBPS配方對焦慮性抑郁癥小鼠抑郁樣行為的影響

在造模21 d后，CRS和CORT注射處理組小鼠強迫游泳行為學(xué)試驗的游泳不動時間和總游泳距離與NC(179.42 s；12.36 m)或VG(211.21 s；11.03 m)相比，分別顯著增加和減少(P<0.05)(表1)。與NC組相比，VG小鼠的不動時間顯著增加(P<0.05)和游泳總距離顯著減少(P<0.05)。結(jié)果表明，21 d連續(xù)CRS可誘導(dǎo)游泳不動時間增加和游泳總距離減少，可造成小鼠明顯的抑郁樣行為。此外，連續(xù)CRS聯(lián)合CORT背部皮下注射可引起小鼠明顯出現(xiàn)抑郁樣行為。給藥處理4周后，PC組游泳不動時間(155.11 s)顯著下降，游泳總距離顯著增加(12.25 m)。而MC組小鼠游泳不動時間最長(260.08 s)和游泳總距離最短(4.06 m)。VG(193.56 s)和VBPSH(186.06 s)組小鼠游泳不動時間與NC(186.17 s)組小鼠相比沒有(P>0.05)顯著差異。PC和VBPS(H、M和L)組小鼠游泳不動時間顯著低于(P<0.05)和游泳總距離顯著高于(P<0.05)MC組小鼠。PC(157.29 s)組小鼠游泳不動時間顯著(P<0.05)低于和游泳總距離顯著高于(P<0.05)VBPS各處理組小鼠。綜上所述，鹽酸氟西汀和VBPS均可顯著改善了焦慮性抑郁癥小鼠的抑郁樣行為，鹽酸氟西汀的效果優(yōu)于VBPS。

表1 VBPS對強迫游泳試驗中小鼠行為的影響?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 VBPS配方對焦慮性抑郁癥小鼠焦慮樣行為的影響

在給藥4周后，不同處理組小鼠在開臂停留時間百分比和開臂進入次數(shù)百分比之間存在顯著差異(P<0.05)，結(jié)果如圖2所示。NC和VG組小鼠在高架十字迷宮試驗中的開臂停留時間百分比均顯著高于各供試品治療組，MC組小鼠開臂停留時間百分比顯著低于(P<0.05)其他組小鼠；PC和VBPSH處理組小鼠的開臂停留時間百分比顯著(P<0.05)高于VBPSM和VBPSL處理組小鼠。NC和VG組小鼠再曠場試驗中的中央停留時間百分比仍然明顯高于(P<0.05)其他處理組小鼠。MC組小鼠試驗結(jié)果表明，中央停留時間百分比明顯低于(P<0.05)其他處理組小鼠。然而，在PC處理組小鼠和VBPS(H、M、L)處理組小鼠中央停留時間百分比與MC組小鼠相比顯著增加(P<0.05)。

在高架十字迷宮測試中，運動軌跡和進入開臂的最大深度表明NC小鼠沒有表現(xiàn)出類似焦慮的行為(圖3)。在MC小鼠中，觀察到在閉臂中的運動較少且在開臂中基本沒有運動，并且觀察到停留在閉臂的角落里，表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為。結(jié)果表明，PC和VBPS可在4周治療后緩解焦慮性抑郁癥小鼠的焦慮樣行為。圖4顯示了在曠場試驗中給藥4周后每組的總運動軌跡(10 min 內(nèi))。MC小鼠大多遠離中心(在邊緣和角落周圍)，然而，PC和VBPS(H、M和L)運動軌跡顯著(P<0.05)增加。因此，結(jié)果表明VBPS在減輕小鼠焦慮樣行為方面更有效。

圖2 VBPS對焦慮性抑郁癥小鼠焦慮樣行為的影響

Figure 2 The effects of VBPS on anxious-like behaviors in the anxious depression mice

圖3 VBPS對焦慮性抑郁癥小鼠高架十字迷宮試驗運動軌跡的影響

2.4 VBPS配方對焦慮性抑郁癥小鼠血清炎癥因子水平的影響

VBPS對焦慮性抑郁癥小鼠炎癥因子的影響如表2所示。與其他組相比，MC小鼠血清炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ)水平顯著(P<0.05)高于其他各組。各組小鼠TNF-α水平按照依次降低的順序為MC>VBPSM>VBPSL>VBPSH>PC>NC>VG。檢測到各組小鼠IL-6的水平按照依次降低的順序為MC>VBPSL>VBPSM>VBPSH>PC>VG>NC。各組小鼠IL-1β的水平依次遞減順序為MC>VBPSM>VBPSL>VBPSH>PC>VG>NC。各組小鼠IFN-γ水平水平按照依次降低的順序為MC>VBPSL>VBPSM>VBPSL>VG>PC>NC。血清IL-6和TNF-α升高被認為是焦慮性抑郁癥的標(biāo)志物，IL-6的增加也被提出可以作為焦慮、抑郁癥加強的預(yù)測，IL-6水平正常化被認為是焦慮和抑郁的緩解癥狀[21-23]。PC和VBPS(H、M和L)組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ水平均顯著高于(P<0.05)NC組小鼠，PC和VBPS(H、M和L)組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ的水平顯著低于(P<0.05)MC組小鼠。血清TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ水平越高說明炎癥反應(yīng)越強。以上結(jié)果表明，MC組小鼠血清炎癥水平較高，通過VBPS灌胃4周后，焦慮性抑郁癥小鼠血清炎癥水平與模型組相比均有顯著下降(P<0.05)，證明其體內(nèi)炎癥反應(yīng)減輕，焦慮性抑郁癥得到改善。因此，VBPS可能是焦慮性抑郁癥小鼠的有效抗焦慮、抑郁膳食補充劑，并且其作用機理可能部分通過抗炎作用介導(dǎo)。

圖4 VBPS對焦慮性抑郁癥小鼠曠場試驗運動軌跡的影響

2.5 VBPS配方對焦慮性抑郁癥小鼠海馬和下丘腦抗氧化能力的影響

研究[24]表明，大腦更容易受到氧化應(yīng)激的不利影響。焦慮性抑郁癥與ROS和RNS升高有關(guān)；此外，ROS和RNS的升高導(dǎo)致MDA增加(由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞膜損傷引起的體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的決定性標(biāo)志)和抗氧化酶活性增加[25-26]。如表3所示，慢性束縛應(yīng)激聯(lián)合皮質(zhì)酮背部皮下注射誘導(dǎo)的焦慮性抑郁癥小鼠的海馬和下丘腦中的MDA水平升高，SOD、CAT、NOS活性增加。NC、VG、PC和VBPS處理組小鼠海馬和下丘腦的MDA濃度顯著降低(P<0.05)于MC組小鼠。NC、VG、PC和VBPS處理組小鼠的SOD、CAT、NOS活性也顯著降低，與MC組相比有顯著差異(P<0.05)。與NC組小鼠相比，PC和VBPS處理組小鼠海馬和下丘腦中的MDA水平和SOD、CAT、NOS活性顯示出顯著增加(P<0.05)。綜上所述，VBPS改善海馬和下丘腦組織MDA水平和SOD、CAT、NOS活性與PC具有相同趨勢。MDA、SOD、CAT、NOS在參與神經(jīng)變性的腦神經(jīng)元中表達增加，其活性增加可能反映了焦慮性抑郁癥的癥狀增加，系統(tǒng)上調(diào)以抵抗焦慮性抑郁中ROS和RNS的增加[25]。試驗結(jié)果表明VBPS能夠有效地降低焦慮性抑郁癥小鼠海馬和下丘腦組織中MDA水平和SOD、CAT、NOS活性，緩解焦慮性抑郁癥小鼠的氧化應(yīng)激損傷。

表2 VBPS對焦慮性抑郁癥小鼠炎癥因子水平的影響?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表3 VBPS對MDA含量和抗氧化酶活性的影響?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.6 VBPS配方對焦慮性抑郁癥小鼠海馬組織TRP代謝的影響

如圖5所示，MC組小鼠的5-HT/Trp和NAD+/KYN比值在海馬組織中均顯著(P<0.05)低于其余各組，而KYN/TRP比值顯著高于(P<0.05)其余各組。5-HT/Trp比值分析可知，PC組與NC組小鼠之間沒有顯著差異，但是VBPS灌胃治療組顯著低于(P<0.05)PC和NC組小鼠。PC、VBPSH和VBPSM組小鼠KYN/TRP比值之間沒有顯著差異，PC和VBPSH組小鼠之間NAD+/KYN比值沒有顯著差異。綜上所述，VBPS能夠提高5-HT/Trp和NAD+/KYN值，降低KYN/TRP的比值，且具有劑量依賴性增加的趨勢。VBPS可能通過降低炎癥因子水平或增加氧化應(yīng)激降低犬尿氨酸代謝途徑的關(guān)鍵限速酶IDO和TDO酶活性，上調(diào)5-HT-TRP代謝，下調(diào)TRP-KYN代謝。通過膳食補充KYN-NAD+途徑輔酶因子維生素B6和NAD+合成的前體物質(zhì)維生素B3，增加NAD+的合成。

圖5 VBPS對焦慮性抑郁癥小鼠TRP代謝的影響

3 結(jié)論

試驗以維生素B族復(fù)合TRP肽和SOD配方(VBPS)作為膳食補充劑，研究VBPS對焦慮性抑郁癥小鼠改善作用。結(jié)果表明VBPS能夠逆轉(zhuǎn)焦慮性抑郁癥小鼠的焦慮樣和抑郁樣行為、改善其體重增加緩慢的癥狀，具有劑量依賴性增加的趨勢。VBPS能夠降低血清NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ水平和MDA的含量，增加SOD、CAT和NOS的活性。此外，VBPS可誘導(dǎo)TRP-KYN代謝下調(diào)和5-HT/TRP、KYN-NAD+代謝上調(diào)。其作用的可能機制為VBPS通過降低炎癥因子水平和增加抗氧化作用降低KYN代謝途徑的關(guān)鍵限速酶IDO和TDO活性，上調(diào)5-HT-TRP代謝，下調(diào)TRP-KYN代謝。通過膳食補充KYN-NAD+途徑輔酶因子維生素B6和NAD+合成的前體物質(zhì)維生素B3，增加NAD+的合成。綜上所述，與焦慮性抑郁癥對照組小鼠相比，VBPS治療的小鼠具有抗炎、抗氧化、逆轉(zhuǎn)焦慮性抑郁癥小鼠行為障礙和體重增加緩慢的作用，從而證明膳食補充VBPS具有顯著的改善焦慮性抑郁癥的作用。