松毛菇多酚抗氧化及抑菌活性研究

李彥坡 - 黃 艷 程璐潔 - 孫怡婷 -

(1.溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 溫州 325000；2.武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

松毛菇又名灰離褶傘、千佛頭、北風(fēng)菌、一窩雞等[1]，主要分布于中國(guó)吉林、黑龍江、河南、青海、云南、西藏及福建北部地區(qū)[2-4]。研究[5-7]表明，松毛菇具有助消化、防治胃腸脹滿和便秘等功效，其提取物對(duì)肉瘤和艾氏癌的抑制率高達(dá) 80%～90%。目前松毛菇收獲后除鮮食外，大部分被制成干菇、罐頭等加工品，但松毛菇中天然有效成分的研究和開發(fā)卻鮮見研究報(bào)道，極大地制約了松毛菇的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

多酚類化合物是廣泛存在于植物中的一類活性物質(zhì)[8]，不僅具有較強(qiáng)的抗氧化作用[9]，還具有抗炎抑菌[10]、抗癌[11]、抗老化[12]、降血壓和預(yù)防心血管疾病[13]等功效，近年來(lái)對(duì)多酚類物質(zhì)的研究已引起研究者的廣泛關(guān)注[14]。目前已見番石榴[15]、海棠[16]、洋蔥[17]等果蔬多酚及檸檬果皮[18]、玉米須[19]等來(lái)源于果蔬副產(chǎn)物的多酚抗氧化和抑菌活性報(bào)道，而關(guān)于松毛菇中多酚類化合物的抗氧化及抑菌活性的研究尚未見報(bào)道。試驗(yàn)擬在前期松毛菇多酚提取純化研究的基礎(chǔ)上，探究松毛菇粗多酚及純化多酚的體外抗氧化活性及抑菌活性，以期為松毛菇多酚的功能特性及高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

松毛菇：武夷山食用菌技術(shù)開發(fā)有限公司；

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

沒(méi)食子酸、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、鄰苯三酚：分析純，上海展云化工有限公司；

1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)：生物試劑，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

抗壞血酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

電子分析天平：AE224C型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

循環(huán)水真空泵：SHZ-DS-Ⅲ型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE2000A型，上海亞榮生化儀器廠；

紫外可見分光光度：UC-6100型，上海元析儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：LGJ-10D型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；

手提式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ-LS-18SI型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

氣浴恒溫振蕩器：SHZ-82A型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

單人單面凈化工作臺(tái)：SW-CJ-1FD型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

高速粉碎機(jī)：6202型，欣鎮(zhèn)精密企業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 松毛菇多酚干品的制備 參照課題組[2]前期研究的方法進(jìn)行松毛菇粗多酚的提取及純化。粗多酚及純化多酚溶液經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥后分別獲得松毛菇粗多酚和純化多酚干品。

1.2.2 松毛菇多酚體外抗氧化活性

(1)清除·OH能力測(cè)定：采用芬頓(Fenton)反應(yīng)法[20-21]，配制9.0 mmol/L的FeSO4、9.0 mmol/L的水楊酸和8.8 mmol/L的H2O2，以及不同濃度的松毛菇多酚樣品和VC待測(cè)液于試管中。分別加入1 mL不同濃度的松毛菇多酚待測(cè)液，然后依次加入1 mL FeSO4和2 mL水楊酸溶液，再加入2.0 mL H2O2，充分混合后置于37 ℃下水浴30 min，510 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1；等體積去離子水替代 H2O2，其余條件一致，測(cè)定吸光度值A(chǔ)0；用等體積去離子水替代樣品測(cè)定吸光度值A(chǔ)2。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，每組試驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。按式(1)計(jì)算·OH清除率。

c={[A0-(A1-A2)]/A0}×100%，

(1)

式中：

c——·OH清除率，%；

A0——無(wú)樣品加H2O2(空白對(duì)照組)的吸光度值；

A1——加樣品和H2O2測(cè)得的吸光度值；

A2——加樣品不加H2O2測(cè)得的吸光度值。

c=[(A2-A1)/A2]×100%，

(2)

式中：

A1——含樣品溶液的吸光度值；

A2——不含樣品溶液的吸光度值。

(3)清除DPPH·能力測(cè)定：采用DPPH比色法[23]。配制不同濃度的多酚樣品和VC待測(cè)液、0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，在試管中依次加入2.0 mL的待測(cè)液和DPPH乙醇溶液，對(duì)照管中依次加入2.0 mL的待測(cè)液和無(wú)水乙醇，空白管中依次加入2.0 mL的DPPH乙醇溶液和無(wú)水乙醇。溶液充分搖勻，室溫下避光放置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度值，依次記為A1、A2、A0。每組試驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。按式(3)計(jì)算DPPH·清除率。

c={[1-(A1-A2)]/A0}×100%，

(3)

式中：

c——DPPH·清除率，%；

A1——樣品待測(cè)液和DPPH乙醇溶液的吸光度值；

A2——樣品待測(cè)液和無(wú)水乙醇的吸光值；

A0——無(wú)水乙醇和DPPH乙醇溶液對(duì)應(yīng)測(cè)得的吸光值。

1.2.3 松毛菇多酚抑菌活性

(1)松毛菇多酚溶液制備：稱取一定質(zhì)量的粗多酚及純化多酚粉末干品，在無(wú)菌操作臺(tái)上加入無(wú)菌蒸餾水溶解，各配制成30 mg/mL的原液，置于冰箱中遮光保存，后續(xù)試驗(yàn)根據(jù)需要可配制成相應(yīng)濃度。

(2)菌懸液及濾紙圓片制備：每次試驗(yàn)前預(yù)先對(duì)大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母5種供試菌進(jìn)行活化，挑取活化過(guò)的各種供試菌的單菌落，接種于裝有10 mL無(wú)菌生理鹽水及無(wú)菌玻璃珠的錐形瓶中，振蕩10 min。采用OD600 nm值法對(duì)菌懸液濁度進(jìn)行調(diào)整，得到108CFU/mL的菌懸液，進(jìn)行梯度稀釋后制備107CFU/mL的菌懸液，備用。

用打孔器打出直徑為6 mm的濾紙小圓片，121 ℃滅菌15 min后烘干、備用。

(3)松毛菇多酚抑菌活性測(cè)定：采用濾紙片擴(kuò)散法[24]。在無(wú)菌操作臺(tái)中，將無(wú)菌濾紙圓片分別置于濃度為10，20，30 mg/mL的松毛菇粗多酚和純化多酚水溶液中浸泡10 h，將無(wú)菌培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，凝固后用無(wú)菌移液管準(zhǔn)確吸取0.2 mL的5種供試菌菌懸液于培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布均勻，靜置10 min。用無(wú)菌鑷子夾取出經(jīng)不同濃度松毛菇多酚溶液浸泡過(guò)的濾紙圓片，瀝干，均勻置于含供試菌的培養(yǎng)基表面，以浸有無(wú)菌生理鹽水的濾紙圓片為空白對(duì)照，每個(gè)平皿均勻放置4片濾紙，編號(hào)標(biāo)記，將含細(xì)菌的培養(yǎng)皿置于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，含有酵母的培養(yǎng)皿置于28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察濾紙圓片周圍是否出現(xiàn)抑菌圈，采用十字交叉法量取抑菌圈直徑，比較不同濃度多酚溶液的抑菌效果。每組試驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

(4)松毛菇多酚最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定：參照李芬芳等[25]的方法并根據(jù)實(shí)際情況有所調(diào)整。將松毛菇粗多酚和純化多酚原液配分別制成2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0 mg/mL 7個(gè)濃度，用移液管準(zhǔn)確吸取各濃度多酚溶液1 mL置于無(wú)菌平板內(nèi)，注入50 ℃無(wú)菌培養(yǎng)基后充分混勻，待培養(yǎng)基凝固后，分別滴加5種供試菌的菌懸液各0.1 mL，用涂布棒涂布均勻，靜置10 min，對(duì)含細(xì)菌和酵母菌的培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。將完全無(wú)菌生長(zhǎng)的平板所對(duì)應(yīng)的松毛菇多酚濃度記為最小抑菌濃度(MIC)。每組試驗(yàn)平行測(cè)定3次。

(5)松毛菇多酚最低致死濃度(MBC)測(cè)定：依次將MIC測(cè)定中未見菌生長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的各培養(yǎng)皿的培養(yǎng)菌，各吸取0.1 mL涂布于相應(yīng)平板培養(yǎng)基上，靜置10 min，對(duì)含細(xì)菌和酵母菌的培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。平板菌落總數(shù)<5的最小稀釋濃度記為最低致死濃度(MBC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 松毛菇多酚體外抗氧化活性

2.1.1 清除·OH能力 由圖1可知，松毛菇粗多酚、純化多酚和VC的濃度越高，對(duì)·OH的清除率越大，即清除能力越強(qiáng)，且影響顯著。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí)，粗多酚、純化多酚和VC對(duì)·OH清除率均達(dá)到最大值，分別為66.44%，69.37%，68.80%，此時(shí)純化多酚的清除率最高，且高于VC。當(dāng)濃度<0.3 mg/mL時(shí)，粗多酚和純化多酚對(duì)·OH的清除率均低于VC；當(dāng)濃度≥0.3 mg/mL時(shí)，松毛菇純化多酚對(duì)·OH的清除率均高于VC。相同濃度下，松毛菇純化多酚對(duì)·OH的清除率均高于粗多酚。綜上，松毛菇粗提及純化多酚均具有較強(qiáng)的·OH清除能力，且清除能力與多酚濃度呈正相關(guān)，當(dāng)濃度>0.3 mg/mL時(shí)，純化多酚的清除能力強(qiáng)于VC。比較相同質(zhì)量濃度的粗提多酚、純化酚與VC對(duì)·OH清除率的效果可知，當(dāng)純化多酚濃度達(dá)到0.2 mg/mL后，純化多酚與VC對(duì)·OH清除率的效果無(wú)顯著差異，濃度達(dá)到0.5%以上后，三者清除·OH的效果無(wú)顯著差異。

小寫字母不同表示組內(nèi)差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

圖1 不同濃度的松毛菇多酚溶液對(duì)·OH的清除能力

Figure 1 The scavenging capacity of polyphenols fromLyophyllumCinoraseensfor ·OH

·OH幾乎能與所有生物大分子(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等)發(fā)生反應(yīng)，其存在與人體衰老、癌癥等多種疾病相關(guān)，因此對(duì)人體危害極大[26]。作為一種天然多酚提取物，在一定濃度下松毛菇純化多酚對(duì)·OH的清除能力強(qiáng)于VC，因此可以考慮將松毛菇純化多酚作為一種外源性自由基清除劑加以利用。

小寫字母不同表示組內(nèi)差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

小寫字母不同表示組內(nèi)差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

圖3 不同濃度的松毛菇多酚溶液對(duì)DPPH·的清除能力

Figure 3 The scavenging capacity of polyphenols fromLyophyllumCinoraseensof different concentrations for DPPH·

2.2 松毛菇多酚抑菌活性

2.2.1 不同濃度松毛菇多酚的抑菌效果 由表1可知，3種濃度(10，20，30 mg/mL)的松毛菇粗多酚對(duì)大腸埃希氏菌無(wú)抑制作用，除革蘭氏陰性的傷寒沙門氏菌外，各濃度的粗多酚對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌、釀酒酵母均有抑制作用，且抑菌圈直徑大小與多酚濃度存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，即抑菌效果隨著多酚濃度的增大而增強(qiáng)。當(dāng)粗多酚濃度為20，30 mg/mL時(shí)對(duì)傷寒沙門氏菌亦呈現(xiàn)抑制作用。相比松毛菇粗多酚，除對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌效果無(wú)顯著變化外，純化多酚對(duì)其他4種供試菌的抑菌圈直徑均明顯增大。不論是粗多酚還是純化多酚，相同濃度下對(duì)釀酒酵母的抑菌圈直徑均最大，說(shuō)明對(duì)釀酒酵母的抑菌效果最好，30 mg/mL時(shí)對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑分別為(10.9±0.2)，(14.7±0.2)mm。綜上，相同濃度條件下，粗多酚及純化多酚均對(duì)釀酒酵母的抑菌作用最強(qiáng)，且純化多酚對(duì)同一供試菌的抑菌作用均強(qiáng)于粗多酚。

2.2.2 最低抑菌濃度和最低致死濃度 由表2可知，在5種供試菌中，松毛菇粗多酚對(duì)釀酒酵母和枯草芽孢桿菌的MIC最低，均為5.0 mg/mL，對(duì)大腸埃希氏菌的最高，為20.0 mg/mL。松毛菇純化多酚亦對(duì)釀酒酵母和枯草芽孢桿菌的MIC最低，均為2.5 mg/mL。粗提及純化多酚對(duì)釀酒酵母的MBC最小，分別為10.0，2.5 mg/mL，對(duì)大腸埃希氏菌的MBC最大，分別為30.0，15.0 mg/mL。純化多酚對(duì)各菌種的MIC和MBC均小于粗多酚，表明純化多酚的抑菌活性強(qiáng)于粗多酚。綜上表明，在5種供試菌中，松毛菇粗多酚及純化多酚對(duì)釀酒酵母的抑菌能力最強(qiáng)，對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌效果最弱，且純化多酚對(duì)各供試菌的抑菌作用均強(qiáng)于粗多酚。

表1 松毛菇多酚對(duì)供試菌的抑菌效果

Table 1 Bacteriostatic effect of polyphenols fromLyophyllumCinoraseenson the tested bacteria(n=3) mm

供試菌 純化前 純化后 10mg/mL20mg/mL30mg/mL10mg/mL20mg/mL30mg/mL對(duì)照大腸埃希氏菌6.0±0.16.0±0.16.0±0.16.3±0.16.7±0.27.0±0.16.0傷寒沙門氏菌6.0±0.17.5±0.310.1±0.27.2±0.18.7±0.212.0±0.26.0金黃色葡萄球菌7.2±0.18.1±0.29.1±0.28.5±0.19.2±0.210.1±0.36.0枯草芽孢桿菌8.3±0.29.0±0.210.3±0.28.9±0.210.4±0.212.3±0.36.0釀酒酵母8.6±0.19.2±0.610.9±0.210.5±0.113.2±0.314.7±0.26.0

表2 松毛菇多酚的MIC和MBC

3 結(jié)論

松毛菇多酚具有良好的抗菌活性，可作為天然抗氧化劑及天然植物抗菌劑應(yīng)用于食品加工與醫(yī)療保健中。后續(xù)試驗(yàn)可利用現(xiàn)代分析方法(HPLC、紅外光譜技術(shù)等)，對(duì)松毛菇多酚化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和組分分析，進(jìn)一步明確其中抗氧化和(或)抑菌效果的主要生物活性成分，探究其作用機(jī)制，并進(jìn)一步將其應(yīng)用于油脂、肉制品、飲料等食品加工中，從而促進(jìn)松毛菇的高值化利用。