miRNA-146a靶向干預改善晚期APP/PS1雙轉基因模型小鼠認知功能的實驗研究

麥 暉 ， 范煒豪 ， 陳雄金 ， 趙 斌 （廣東醫科大學附屬醫院 . 神經病學研究所；. 神經內科，廣東湛江 5400）

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是發生于老年和老年前期的一種漸進性的神經退行性疾病，是老年人中最常見的癡呆性疾病。據統計，65歲以上老年人約有5%患有AD，至2015年我國AD患者超過900萬人，患病人數居世界第一，預計至2050年我國老齡化人口將超過4億人[1]。AD發病后難以治愈，目前主要的療法只限于短期緩解發病癥狀。臨床藥物如膽堿酯酶抑制劑或谷氨酸受體拮抗劑只能改善癥狀，不能徹底治愈，而治療AD的藥物臨床試驗進展不盡人意，AD的發病機制、實際治療策略及新的治療靶點均有待進一步研究[2]。MicroRNA(miRNA)是一類在生命進程中具有保守性及穩定性的內源性非編碼RNA。miRNA通常被認為是細胞命運的決定因素，是各種腦部疾病的關鍵調節因子，有望成為治療神經退行性疾病的靶點[2-3]。miRNA-146a是AD與炎癥有關的一種miRNA，它可以調控先天免疫。AD腦解剖病理結果提示，在海馬和顳葉皮層，miRNA-146a表達上調；而在未受影響的區域miRNA-146a 水平保持不變[4]。此外，miRNA-146a不僅參與調節先天免疫，還影響造血功能和細胞分化等[5-6]。前期研究發現，miRNA-146a在AD發病過程中具有重要的作用，可能是AD的一個潛在新靶點[7]。目前大眾對AD 的認識普遍不足，臨床上確診的AD患者大多已處于晚期，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。本研究試圖通過實驗研究明確miRNA-146a是否能改善晚期APP/ PS1雙轉基因模型小鼠的行為認知功能，是否為AD 的潛在治療靶點，為AD患者新型藥物的研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 試劑

miRNA-146a agomir 和DEPC(diethyl pyrocarbonate) 為廣州艾基生物技術有限公司產品；Aβ42 ELISA試劑盒為美國invitrogen公司產品；六氟異丙醇(HFIP) 為美國Sigma公司產品；OCT包埋劑為美國櫻花SAKURA公司產品；Aβ抗體、Aβ42抗體、P-tau T181、tau 46、β-actin 抗體、HRP標記二抗為美國CST公司產品；Flour 488熒光二抗、DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)、 P-tau S396抗 體 、 P-tau T205抗體為英國abcam公司產品；脫脂奶粉為美國BD公司產品。

1.2 實驗動物

SPF(specific pathogen free)級18月齡APP/PS1雙轉基因小鼠12只，18月齡相同背景非轉基因野生型小鼠(C57BL/6型，簡稱C57小鼠)6只，均為雄性。試驗動物由廣東省實驗動物中心提供，飼養于廣東醫科大學實驗動物中心SPF級房，22～26 ℃，濕度為55%～65%，12 h光暗周期條件下飼養(早上7點打開照明裝置，19時關閉照明裝置)，自由獲取食物和水源。本實驗已通過廣東醫科大學倫理委員會審核，遵循相應動物實驗操作規范。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 隨機將18月齡AD小鼠分為AD組和ADI組(干預組)，每組6只，18月齡C57小鼠6只作為CON組。

1.3.2 動物給藥 實驗動物按照Hanson等[8]方法予小鼠鼻腔滴注給藥。(1) 將實驗劑量1 nmol miRNA-146a agomir溶于24 μL無酶的DEPC水中，冰盒中保存。(2) 在正式實驗前2周，用2.5 μL移液槍給小鼠用生理鹽水滴鼻。正式實驗時，ADI組給予miRNA-146a agomir，每次1 μL，兩個鼻孔交替滴注，總量達8 μL 后，給予小鼠休息5 min， miRNA-146a agomir充分吸收后，再進行下一個輪回，3個輪回將24 μL滴注完。隔天干預1次，共15次。AD組和CON組小鼠均給予同等體積的載體DEPC水。

1.3.3 Morris水迷宮檢測 30 d給藥結束后，全部小鼠開始進行Morris水迷宮測試，用于考察實驗小鼠的學習記憶情況。Morris水迷宮行為檢測系統由圓形水槽、平臺和數據采集系統組成。(1)定位航行實驗：定位航行實驗用于測量小鼠對水迷宮學習和記憶的能力，共歷時5 d，平臺固定在NW象限下1 cm，每天每只小鼠連續訓練4次。訓練時每次將小鼠從不同象限邊緣中點位置面向池壁放入水中，觀察并記錄小鼠在90 s內找到平臺的時間(平臺上停留時間超過10 s)，即為逃避潛伏期。如果小鼠在90 s內未能找到平臺則人為引導至平臺，停留10 s后移開，逃避潛伏期記為90 s。每次訓練完后，用干毛巾擦干小鼠，防止低體溫造成的應激干擾結果。(2)空間搜索實驗：空間搜索實驗用于測量小鼠學會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的能力。實驗第6天時撤除平臺，選SE象限將小鼠面向池壁放入水中，記錄90 s內小鼠穿越平臺所在位置次數、在平臺所在象限的停留時間及游泳路程百分比。

1.3.4 Y迷宮檢測 Y迷宮主要應用于動物的辨別性學習、工作記憶和參考記憶的測試。Y迷宮用醫用有機板制作，內外壁貼黑色膠紙，共3個臂，各臂夾角為120°，每一臂尺寸為30 cm×8 cm×15 cm(長×寬×高)，中央處各有1個可移動的隔板，在迷宮各個臂內貼上不同的幾何圖形，作為視覺標記。每個Y迷宮的3個臂被隨機設為新異臂、起始臂和其他臂。新異臂：在實驗的第一階段即訓練時期用隔板擋住，在第二階段即測試期打開；起始臂：小鼠進入迷宮所在的臂。整個實驗過程中起始臂和其他臂都是一直打開，動物可以自由出入。迷宮內鋪墊木屑，每次訓練或測試結束后，混勻各個臂的木屑，以防止動物殘留氣味干擾。迷宮上方1.5 m處安置攝像頭，全過程錄像。檢測小鼠自發性交替反應和空間識別能力。

1.3.5 小鼠海馬組織樣品的準備 磁共振檢測完成后，各組小鼠用10%水合氯醛(按照0.35 mL/100 g)腹腔注射，麻醉后心臟右心耳小剪刀剪開小口，左心室快速灌注4 ℃預冷的生理鹽水，至右心耳流程清亮液體，肝臟發白后，改用4 ℃預冷4 %多聚甲醛快速灌注，隨后斷頭取腦，腦組織沿矢狀面一分為二。其中一側腦組織迅速分離出海馬組織置于－80 ℃保存備用，進行后續分析；另一側腦組織置于4 ℃預冷的4 %多聚甲醛-PBS(phosphate buffer saline)溶液(pH=7.4)中固定過夜，OTCB包埋，然后按冠狀面將組織切成25 μm厚的冰凍薄片，用貼片法將腦片吸附于防脫片玻片上，按不同實驗組將片放置于切片盒－80 ℃低溫冰箱保存備用。

1.3.6 免疫熒光檢測 冰凍切片免疫熒光檢測小鼠顱內Aβ/Aβ42蛋白含量。具體步驟如下：將腦組織片從-80 ℃冰箱取出，放置在片架上置入37 ℃溫箱30 min，用免疫組化筆做好標記后置入玻璃染缸中給予PBS(pH 7.2～ 7.4)，室溫下洗3次，每次5 min。隨后加10 %同源羊血清(與二抗同來源)于濕盒中常溫封閉1 h。封閉結束后將其中的封閉液吸干，滴加一抗，置入濕盒中4 ℃冰箱孵育過夜。第2天，從4 ℃冰箱中取出濕盒，室溫下復溫1 h，隨之置入玻璃染缸中給予PBS，室溫下洗3次，每次5 min。避光用移液槍滴加配制好的熒光二抗(采用封閉液稀釋)，后將濕盒置入37 ℃恒溫箱中孵育1 h，從溫箱取出后予PBS室溫下洗3次，每次5 min。待片子干后，滴加DAPI，避光室溫孵育3 min，隨后置入玻璃染缸中室溫下PBS洗3次，每次5 min，風干后加入放猝滅劑并蓋上玻片。TCS SPE5 萊卡共聚焦顯微鏡下觀察海馬區熒光表達情況。Aβ一抗1:100稀釋、Aβ42一抗1:1 600稀釋，二抗均按1:1 000稀釋。

1.3.7 ELISA法檢測Aβ42含量 按照說明書要求進行ELISA檢測Aβ42含量，具體步驟如下：從－80 ℃冰箱取出各月齡小鼠每個樣本海馬組織(約30 mg)，沖洗干凈后，按每100 mg樣本加入含1×蛋白水解酶抑制劑1.0 mL的PBS進行勻漿，4 ℃ 15 000 r/min離心30 min后收集上清，分裝、標記。在離心后的沉淀物中加入1 g/L六氟異丙醇200 mL后震蕩混勻，離心收集上清，分裝、標記。然后按照操作手冊分別檢測可溶性和不可溶性Aβ42水平。

1.3.8 Western blotting檢測 按等質量取已提純的海馬組織蛋白30 μg進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，接著將目標蛋白從凝膠中轉移至PDVF(polyvinylidene fluoride)膜上，用TBST(Tris-Buffered Saline Tween-20)溶液洗滌：每次5 min，共3次；將PVDF膜放入 5%脫脂奶粉溶液中常溫封閉2 h(搖床中慢搖)；用 1%的脫脂奶粉稀釋一抗(兔抗P-tau S396，1:500稀釋；兔抗P-tau T205，1:1 000稀釋；兔抗P-tau T181，1:500稀釋；兔抗tau46，1:500稀釋；內參β-actin，1:1 000稀釋)，4 ℃搖床過夜；次日常溫復溫40 min，用TBST洗滌3次，每次5 min；洗完后用1 %的脫脂奶粉稀釋二抗(HRP標記的羊抗兔二抗，1:20 000稀釋)，37 ℃搖床孵育2 h。用TBST溶液洗滌3次，每次10 min；暗房避光，ECL法化學發光顯影、定影。膠片曝光后用掃描儀進行條帶掃描，灰度分析結果。

1.4 統計學處理

采用 Graphpad Prism 6.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，采用one-way ANOVA及q檢驗分析各組樣品數值間的差異。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學檢測結果

2.1.1 Morris水迷宮檢測結果 如圖1A所示，在定位航行訓練實驗中，隨著訓練時間的增加，各組小鼠找到平臺的時間(即逃避潛伏期)逐漸縮短。與AD組小鼠相比，ADI組小鼠在定位航行實驗2、3、4、5 d的逃避潛伏期明顯縮短，定位巡航運動軌跡也同樣明顯縮短，差異均有統計學意義(P<0.01)。圖1B～D所示，與AD組小鼠相比，ADI組小鼠在原平臺所在象限停留時間及游泳路程百分比都明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05或0.01)；而穿越原平臺次數雖略有增多，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.1.2 Y迷宮方法檢測結果 在自發交替反應中，ADI組小鼠正確率較同月齡AD組小鼠雖略有增加，但差異無統計學意義(P>0.05)；ADI組小鼠在新異臂的停留時間以及在穿越新異臂的次數均比同月齡AD組小鼠明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05或0.01)。詳見圖1E～G。

2.2 miRNA-146a agomir對 APP/PS1小 鼠 腦 組 織Aβ和Aβ42沉積的影響

ADI組小鼠與AD組比較，海馬區Aβ和Aβ42沉積斑數量(綠色熒光)均顯著降低(圖2A)，兩組海馬可溶性和不可溶性Aβ42含量的比較差異亦有統計學意義(P<0.05或0.01，圖2B～C)。

2.3 miRNA-146a agomir對APP/PS1小鼠海馬區tau蛋白異常磷酸化水平的影響

圖1 18月齡3組小鼠行為學檢測結果

如圖3所示，AD組小鼠與CON組相比，海馬組織中P-tau S396、 P-tau T181和P-tau T205蛋白異常磷酸化水平明顯增加；ADI組小鼠與AD組相比，海馬海馬組織中P-tau S396、P-tau T181和P-tau T205蛋白異常磷酸化水平明顯減少，差異均有統計學意義(P<0.05或0.01)。

3 討論

AD是一種錯綜復雜的多病因和多發病機制的神經退行性疾病，由多個基因、通路以及蛋白的失調引起，到目前為止其發病機制尚不明確。研究表明，神經內分泌免疫網絡失調也是AD發病的機制之一，且在AD的發病機制中處于核心地位[9-10]。身體的免疫系統炎癥與AD密切相關，而先天性免疫系統對腦代謝、神經保護和修復等方面是至關重要的。一旦免疫系統和炎癥信號途徑被激活，機體就會產生過量的氧自由基，同時促炎性細胞因子以及前列腺素也會大量表達，進而引發炎癥級聯反應，Aβ異常沉積及tau過度磷酸化，最終導致突觸降解和神經元死亡，從而導致神經退行性疾病和AD的發生和進展[10-12]。

miRNAs已經成為基因表達的關鍵調控因子，并且被證明可影響多種細胞生物學過程，包括增殖、分化、存活和遷移等[13-15]。中樞神經系統中也有自己獨特的miRNA，參與神經系統疾病的生理、病理及生物反饋過程，如神經細胞發育、膠質細胞增生、神經細胞凋亡及壞死等。在AD患者海馬中檢測到多種 miRNA， 如 miRNA-16、 miRNA-34c、 miRNA-107、miRNA-128a和miRNA-146a[3,16]。miRNA-146a免疫炎癥相關的靶基因，包括IRAK1、TRAF6、CXCR4、CFH、COX2、ROCK1、EGFR、Notch1和STAT1[17-18]，參與了多種病理、生理過程和疾病相關的免疫炎癥反應[5,19-21]。miRNA-146a還可作用于APP金屬蛋白酶10(ADAM10)的關鍵調節因子跨膜四旋TSPAN12，從而影響Aβ的代謝[22]。而β樣淀粉蛋白在腦內沉積對神經細胞的毒性是AD發病的關鍵因素[23]。近年來也有研究認為Aβ是tau的上游調節途徑，其毒性引起tau功能異常。換而言之，tau過度磷酸化通常被認為是淀粉樣變性的結果，而不是該疾病發病機制中的一個獨立事件[24]。反之異常磷酸化的tau也可增加Aβ的毒性[25]，兩者相輔相成。

圖2 miRNA-146a agomir干預后 APP/PS1小鼠腦組織海馬區Aβ的沉積情況

圖3 miRNA-146a agomir干預后APP/PS小鼠海馬中tau蛋白磷酸化情況

Morris水迷宮是目前評價動物學習與記憶的應用最廣范的模型，可用于測試實驗動物對空間位置覺和方向覺(空間定位)的學習記憶能力。Y迷宮實驗模型用來研究嚙齒類動物的空間識別記憶能力。相對于被動回避等實驗，這種迷宮利用了嚙齒類動物對新異環境天然探究的自然習性，不需要動物學習任何的規則來趨利避害，能夠有效地反映動物對新異環境的識別記憶能力。在本研究中2個迷宮測試結果均有力證實了miRNA-146a agomir 靶向干預后，明顯改善了晚期AD模型小鼠的行為認知能力。分子層面上，我們發現干預后的AD模型小鼠其海馬區Aβ、Aβ42蛋白的沉積及tau蛋白的異常磷酸化水平與AD 正常小鼠相比明顯降低。結合目前公認的AD典型神經退行性病變的主要表現為：(1)學習記憶力功能減退及損傷；(2)不同腦區(包括海馬、皮質等)Aβ聚集形成老年斑(SP)；(3) tau 蛋白過度磷酸化聚集形成神經原纖維纏結(NFTs)；(4)大量神經元損傷和數目的減少，突觸功能紊亂以及嚴重的軸突和樹突骨架的破壞[26-27]。某種程度上可以說，miRNA-146a agomir干預后全面緩解了AD模型小鼠的病理、生理進程，在活體動物實驗中表現為行為認知能力得到明顯改善。

綜上所述， miRNA-146a agomir靶向干預可改善晚期AD小鼠的行為認知功能障礙，降低AD小鼠海馬區Aβ、Aβ42蛋白的沉積及tau蛋白的異常磷酸化水平，緩解AD病理、生理進程。本研究為尋找AD治療的新靶點提供了新的線索和思路。