MET突變與非小細胞肺癌患者臨床病理特征及預后的關系

楊 爽，馮衛能，張 華，梁劍苗 （廣東省佛山市第一人民醫院頭頸胸腫瘤內科，廣東佛山528000）

非小細胞肺癌(NSCLC)早期癥狀不典型，確診時多處于晚期，失去手術機會，主要通過放療和化療延長生存期，但傳統放療、化療效果不佳[1]。有報道顯示NSCLC驅動基因靶向藥物靶點確切、療效佳、不良反應少，能顯著改善NSCLC患者預后[2]。間質-上皮細胞轉化因子(MET)是目前NSCLC分子治療的又一重要靶點[3]，但MET基因突變與NSCLC患者病理特征及預后有何關聯尚不清楚。本文回顧性分析NSCLC患者的臨床資料，探討MET突變與NSCLC患者病理特征及預后之間的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

經醫學倫理委員會批準，回顧性分析我院2014年1月－2015年1月收治的315例NSCLC患者臨床病案資料。診斷標準：參照《非小細胞肺癌免疫組化標志物專家共識(2014)》[5]。納入標準：⑴經組織病理學確診NSCLC患者；⑵年齡≥18歲。排除標準：⑴精神障礙者；⑵合并嚴重肝、腎功能障礙；⑶合并血液系統、免疫系統疾病；⑷N3期及以上患者。315例中男167例，女148例；年齡41～73歲，平均年齡(62.51±6.30)歲；鱗癌169例，腺癌146例；病理分期：Ⅰ期65例，Ⅱ期94例，Ⅲ期119例，Ⅳ期37例。所有患者均簽署知情同意書。所有患者隨訪直至死亡。

1.2 方法

組織標本：均來源于臨床穿刺取樣，石蠟保存、切片。

NGS檢測方法：(1)DNA提取和定量。于室溫環境中解凍細胞顆粒后，盡量刪除媒體或PBS解凍丸。DNA提取采用DNeasy血液組織工具(Hilden，德國)。純化后的DNA通過Nanodrop One(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)鑒定合格，并且采用制造商的推薦使用dsDNA HS檢測試劑盒(Life Technologies，Eugene，OR，USA)通過Qubit 3.0 (Life technology，Singapore，Singapore)定量。(2)測序準備：測序庫采用KAPA Hyper準備試劑盒(KAPA Biosystems，南非)，將50 ng-1 μg的DNA基因組片段剪成350個基點，接受End-repairing，與索引適配器連接后，選擇使用Agencourt AMPure XP珠子，最終通過PCR擴增文庫，純化，富集目標。(3)雜交捕獲和測序：加入人gt -1 DNA (Life Technologies)和xGen Universal blocking oligos (Integrated DNA Techno-logies)作阻斷劑。用geneseeq422探針(geneseeq1)進行雜交富集。捕獲反應用NimbleGen SeqCap EZ雜交、Wash試劑盒(Roche，Madison，WI，USA)以及Dynabeads M-270(Life Technologies，維爾紐斯，立陶宛)進行，并采用優化制造商協議。捕獲的文庫是用Illumina p5 (5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3') 和p7引 物(5'-CAAGCAGAAGACGGCAT ACGAGAT-3')擴增的珠上文庫(KAPA HiFi HotStart ReadyMix, KAPA Biosystems，開普敦，南非)。捕獲后的擴增文庫由agt AMPure XP beads純化，使用KAPA文庫定量試劑盒(KAPA Biosystems，Cape Town，South Africa)進行qPCR定量。文庫片段大小由安捷倫科技2100生物測定。

1.3 評價指標

檢測結果和生存情況：統計所有患者的MET突變情況、中位生存期。

MET突變與NSCLC病理特征的關系：分析患者的臨床資料，從年齡、性別、吸煙與否、組織類型、腫瘤分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移等方面分析與MET突變的關系。

MET突變與NSCLC預后的關系：從患者年齡、性別、吸煙情況、腫瘤分期、病理類型、MET突變方面評價NSCLC患者的中位生存期。

NSCLC患者預后的多因素分析：采用Cox模型進行多因素影響分析。

1.4 統計學處理

采用SPSS19.0軟件統計分析，計量資料以±s表示，采用獨立樣本t檢驗，計數資料比較采用卡方檢驗，MET突變與NSCLC預后關系采用Log-rank檢驗，采用Cox進行回歸分析影響預后的因素。檢驗水準=0.05。

2 結果

2.1 檢測結果和生存情況

315例NSCLC患者中MET突變陽性34例，MET突變陽性率為10.79%；隨訪結果顯示，315例患者的中位生存期為31個月。

2.2 MET突變與NSCLC病理特征的關系

表1 MET突變與NSCLC病理特征的關系

MET突變與NSCLC患者的年齡、性別、吸煙情況、腫瘤分期、組織類型、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況均無關(P>0.05)，見表1。

(續上表)

2.3 MET突變與NSCLC預后的Log-rank分析

影響NSCLC預后的因素有TNM分期及MET突變(P<0.01)，NSCLC的預后與患者年齡、性別、吸煙情況、組織類型無關(P>0.05)，見表2。

表2 MET突變與NSCLC預后的Log-rank分析

2.4 影響NSCLC預后的多因素Cox回歸分析

將NSCLC患者TNM分期情況Ⅰ/Ⅱ期賦值為0，Ⅲ/Ⅳ期賦值為1，MET突變陽性賦值為0，陰性賦值為1，經Cox回歸分析顯示MET突變和TNM分期是NSCLC患者預后的獨立影響因素(P<0.01)，見表3。

3 討論

據世界衛生組織統計，全球每年肺癌發病例數超1 000萬，占惡性腫瘤新發病例數的13%，因癌癥而死亡的患者中肺癌占19%，肺癌發病率和病死率居惡性腫瘤首位[6]。肺癌中NSCLC發病率占80%～85%。雖然目前肺癌病死率仍然極高，但某些特定基因突變的NSCLC患者經靶向治療，預后得到了明顯改善[7]。隨著醫學分子生物學研究發展，人們對腫瘤驅動基因的認識逐漸深刻，通過檢測NSCLC患者腫瘤異質性并制定個體化治療方案已成為新趨勢。目前絡氨酸激酶抑制劑已被批準臨床用于治療表皮生長因子受體(EGFR)重排的NSCLC患者，且靶點確切、療效佳、不良反應小，能顯著改善患者預后。而其他在NSCLC患者中已知的基因改變，如FGFR1、KRAS、NRAS、MET等也是目前研究熱點。其中MET基因突變被認為是繼EGFR之后又一個NSCLC分子治療的重要靶點，但目前臨床研制的靶向MET和其配體HGF的藥物均以失敗告終。因此本文回顧性分析我院NSCLC患者資料，通過NGS法檢測MET基因突變情況，探討MET突變與肺癌患者病理特征和預后的關系，為臨床研究提供科學依據。

臨床研究發現MET突變不與其他基因突變共存，提示MET突變可能是一種獨立的致癌驅動基因[8]。MET突變包括體系突變和種系突變。在NSCLC患者中，MET基因主要突變于sema結構和JM結構。研究表明sema結構域中有多種錯意突變如S178、L211W會影響MET和HGF的結合和下游信號激活過程[9]。而JM結構域的Tyr1003發生點突變成為苯丙氨酸時，會影響MET泛素化和降解，從而持續激活MET通路。MET與EGFR同位于7號染色體，編碼蛋白同樣屬于受體絡氨酸激酶，MET突變導致持續高度磷酸化會激活MET/HGF信號通路，促使NSCLC的發生、浸潤、轉移、分裂加速等。但同時有研究指出，MET基因的異常如擴增、過度表達、外顯子突變等與NSCLC患者病理特征無顯著相關性[10]。近年除對MET擴增研究較多外，MET14外顯子突變也是研究的重點項目，且有相關證據指出MET14外顯子突變采用克唑替尼治療預后較MET擴增優。也曾有學者研究發現，MET基因突變與NSCLC患者吸煙有一定關聯性[12]。但因其研究樣本量過小，結論尚存在爭議。本文中，經單因素分析結果顯示，MET 突變與患者吸煙與否無明顯相關性，與報道結論不一致。文獻結果表明MET基因突變易出現在腺癌患者中[11]。本文結果中腺癌患者出現MET突變19例，鱗癌患者出現MET15例，腺癌患者MET突變率略高于鱗癌，但差異不明顯。回顧性分析結果顯示，NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤分期、組織類型、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況與MET突變均無明顯關系，這可能與本研究中納入樣本量過少有關。

表3 影響NSCLC預后的多因素Cox回歸分析

相關報道指出原癌基因MET編碼的MET蛋白是50×103的α亞基以及145×103的β亞基經二硫鍵連接而形成的異二聚體。MET受體和其配體HGF結合后會激活受體發生磷酸化，導致多種底物蛋白發生磷酸化并傳導細胞內一系列信號，激活PI3K/AKT、MEK/ERK等通路，產生多種生物效應如促進細胞增殖、侵襲、運動、改變血管形態、調節血管形成等，從而影響預后。李佳濃等[9]研究發現MET突變陽性NSCLC患者中位生存期顯著低于MET突變陰性者，且經多變量模型證實MET陰性NSCLC患者能顯著降低死亡風險。本文結果也顯示MET突變陽性者的平均生存期顯著低于MET突變陰性者，且MET突變是NSCLC患者預后的獨立危險因素。

綜上所述，MET突變是NSCLC預后的獨立危險因素，MET突變陽性的NSCLC患者預后較差，MET突變與NSCLC患者病理特征則無明顯關系。