PCR熒光和PCR膜雜交檢測HPV-DNA的比較研究

董福昌

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發病的主要誘因是人類乳頭瘤病毒（HPV）感染。有研究顯示美國50 歲以上的婦女80%會感染一次乳頭瘤病毒感染。不同類別的HPV感染其致病性存在顯著差異[1]。早診斷HPV感染有助于宮頸上皮內瘤病變進一步惡化，因此是醫學研究的關鍵[2]。目前國內檢測HPV-DNA的方法是PCR-熒光法與PCR-膜雜交法[3]。文章探索PCR-熒光法與 PCR-膜雜交法在檢測HPV-DNA中的應用對比研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年8 月-2019 年8 月收集送至本醫學檢驗實驗室的208 例標本，患者年齡22～65 歲，平均年齡（38.32 ±5.6）歲，患者均接受HPV和組織學檢測。采集受檢者的宮頸口鱗、柱狀上皮交界處，采用專用脫落細胞采集器進行采集，并進行細胞組織學檢測。

1.2 方法 ①PCR-熒光法：取2 uL的待測DNA加入到試劑盒的反應管中，在同一PCR反應中檢測宮頸脫落細胞中的13 種高危型HPV-DNA包括：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、58、59、68。反應溫度50 ℃，2 min，95 ℃，10 min。循環40個。使用熒光PCR檢測儀并且記錄熒光標記探針在分子雜交時的熒光能量變化。采用自動記錄熒光值變化并轉換成DNA模板量，判斷檢測結果。全程設置HPV陰性對照和臨界陽性對照，從而控制質量。②PCR-膜雜交法：采用反向點雜交檢測擴增產物和包被有型特異性探針膜雜交結果，再進行定性檢測，對21 種HPV基因型：HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68進行分型檢測。標本采集，按比例將PCR Mix、Taq酶和DNA模板混勻。擴增溫度：95 ℃，9 min，循環40 個。陽性結果顯色為清晰可見的藍紫色圓點。設置陰、陽性對照，從而控制質量。

1.3 細胞學檢查 按照細胞組織學診斷分為惡性病變、非典型鱗狀上皮細胞增生、鱗狀上皮細胞病變，宮頸鱗癌。

1.4 統計學方法 數據采用SPSS 20.0 統計軟件進行分析，計數資料以[n(%)]的形式表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 PCR-熒光法與 PCR-膜雜交法在細胞組織學分組中的檢測陽性情況 208 例標本，采用PCR熒光法檢測HPV-DNA陽性率（34.62%）低于PCR-膜雜交法檢測陽性率（46.63%）；其中細胞組織學診斷的異常細胞154例中PCR-熒光法檢測陽性率（14.29%）低于PCR-膜雜交法檢測的陽性率（28.57%），差異具有統計學意義（P＜0.05）；54例細胞異常患者的PCR-熒光法和PCR-膜雜交法的檢測比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 PCR-熒光法與 PCR-膜雜交法在細胞組織學分組中的檢測陽性情況 例(%)

2.2 惡性病變組和細胞異常組的患者采用兩種方法檢測的情況比較 惡性病變組分別采用PCR-熒光法和PCR-膜雜交法檢測陽性率分別為14.29%、28.57%，差異有統計學意義（P＜0.05）；細胞異常組分別采用PCR-熒光法和PCR-膜雜交法檢測陽性率分別為92.59%、98.15%，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組患者采用兩種方法的檢測情況比較 例(%)

3 討 論

PCR-膜雜交法是通過檢測位點是否出現出現信號判斷，而信號點的強弱反映定量信息。當PC位點外膜條上各檢測位點有信號，還能分辨混合型感染[4]。PCR-熒光法能夠實時監測熒光擴增過程，能夠進行準確的半定量分析，有助于篩查高危HPV亞型的患者，具有操作簡單、快速省時、分析準確、成本低、適用樣本類型多等優點，是HPV檢測的優選方法[5]。

本文結果顯示送至本醫學檢驗實驗室的208例標本，采用PCR熒光法檢測陽性72 例，陰性136例，陽性率是34.62%，采用PCR-膜雜交法檢測陽性97 例，陰性111 例，陽性率是46.63%。說明兩種方法檢測不同細胞組織學分類中陽性比例不同。通過細胞組織學診斷的異常細胞54 例，比例是25.96%，惡性病變組的患者分別采用PCR-熒光法和PCR-膜雜交法的檢測HPV-DNA的陽性率是14.29%、28.57%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。原因是PCR熒光法的檢測人群僅限于13 種類型的高危HPV。細胞異常組的患者分別采用PCR-熒光法和PCR-膜雜交法的檢測HPVDNA的陽性率是92.59%、98.15%，差異無統計學意義（P＜0.05）。說明HPV感染與宮頸癌的病變具有顯著的相關性。

綜上所述，PCR-熒光法在臨床診療篩查中應用效果很好，PCR-膜雜交法在非高危性HPV的檢測中應用效果較好，PCR檢測HPV-DNA具有很高的特異性和敏感性。