二氧化硫保鮮劑預處理對葡萄酒香氣和生物胺含量的影響

劉靜芳，張博欽，朱本忠，段長青，燕國梁

（1.中國農業大學 食品科學與營養工程學院葡萄與葡萄酒研發中心，北京 100083；2.農業農村部葡萄與葡萄酒重點實驗室，北京 100083）

葡萄酒是用新鮮的釀酒葡萄或葡萄汁經完全或部分發酵釀成的酒精飲料，隨著我國人民生活水平的提高，葡萄酒受到越來越多的歡迎[1]。根據國際葡萄與葡萄酒組織（international organisation of vine and wine，OIV）公布的數據顯示，2016年中國葡萄酒消費量初步統計達17.2億L，增幅位居全球之首[2]。葡萄酒的品質很大程度上取決于其原料—葡萄的品質[3]。與鮮食葡萄不同，釀酒葡萄具有皮厚、粒小、糖度和單寧含量高的特點[4]。一般情況下，采收后的釀酒葡萄會立即進行除梗破碎，并進行發酵，但有時葡萄采收地與生產釀造地距離較遠，需要進行運輸，在這一過程中不恰當的儲藏方式可能會造成釀酒葡萄的腐爛和品質的變化，進而對葡萄酒的品質產生不利的影響。而目前對葡萄儲藏方式的研究主要集中在鮮食葡萄[5]，而對于釀酒葡萄儲藏方式的研究卻還是空白。

目前，最為常見的儲藏方式就是低溫儲藏和添加SO2保鮮劑儲藏。低溫是儲藏葡萄（水果）最主要的方式，低溫（4 ℃）能夠抑制水果呼吸作用和乙烯的合成，從而延緩呼吸高峰期的到來，實現保鮮目的[6]。而在葡萄采后儲藏和運輸過程中除了葡萄果實自身的變化外，還會受到灰霉菌以及各種細菌（醋酸菌）的侵襲[7]。SO2保鮮劑不僅對灰霉菌有強烈的抑制作用，抑制多酚氧化酶等酶的活性，而且可以降低果實與果梗的呼吸強度，提高果實耐貯性，延長葡萄保鮮期[8-9]。因此，采用保鮮劑結合低溫能夠有效抑制葡萄果實的呼吸作用以及雜菌的生長與繁殖，是儲藏鮮食葡萄的主要方式。

本研究借鑒鮮食葡萄的保鮮方法，在低溫（4 ℃）條件下，采用不同劑量的SO2保鮮劑對釀酒葡萄（赤霞珠葡萄）進行預處理，進而進行4周的儲藏，將儲藏不同周數的紅葡萄分別進行酒精和蘋乳發酵，通過測定葡萄酒主要成分，香氣產物以及生物胺的含量變化來評價該儲藏方式的可行性，為釀酒葡萄的儲藏提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄果實（還原糖含量為230.55 g/L）：河北昌黎產區；葡萄專用快速釋放型SO2保鮮劑（2號保鮮劑）：天津綠達保鮮工程技術有限公司；釀酒酵母（ADT）：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌（Viniflora?Oenos）：丹麥科漢森公司。

葡萄糖、果糖、甘油、乙醇、蘋果酸、檸檬酸、硼酸、硼砂、無水乙酸鈉（純度均＞99%）：北京化學試劑公司；甲醇、正己烷（純度99.9%）：美國Tedia公司；乙氧亞甲基丙二酸二乙酯（diethyl ethoxymethylene malonate，DEEMM）、酒石酸、琥珀酸、乳酸、乙酸及生物胺標準品（純度均＞99%）：美國Sigma-Aldrich 公司；香氣化合物標準品（純度99%）：瑞士Fluka公司、美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

裝備有示差折光檢測器和紫外分光檢測器的Agilent 1200 Series 高效液相色譜儀、Agilent 6890 氣相色譜儀、Agilent 5975B質譜儀、聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB）萃取頭和ZORBAX SB-C18色譜柱：美國安捷倫科技有限公司；HPX-87H色譜柱：美國Bio-Rad公司；UV2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；FA1104電子天平：上海恒平科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 赤霞珠葡萄果實貯藏及釀造流程

將赤霞珠葡萄分別儲藏1、2、3和4周，均設SO2無添加（1-N、2-N、3-N、4-N）、低濃度（2 g SO2/kg葡萄）（1-L、2-L、3-L、4-L）和高濃度（4 g SO2/kg葡萄）（1-H、2-H、3-H、4-H）3個梯度，以新鮮的葡萄為對照（0-N），共13個分組，每組設3個重復。將各試驗組的赤霞珠葡萄分別放入密封的塑料袋中，扎口儲藏，儲藏溫度為4 ℃，每隔一周取所儲藏的赤霞珠葡萄進行葡萄酒發酵試驗，發酵罐為3 L玻璃發酵罐。酒精發酵及蘋乳發酵結束后，分別收集發酵液，于8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液儲藏于-20 ℃冰箱，用于各種指標的測定。釀造流程如下：

1.3.2 測定方法

腐爛率及落果率計算公式如下：

主要代謝產物測定[10]：使用高效液相色譜儀進行主要代謝產物的測定。離子交換色譜柱為HPX-87H（300 mm×7.8 mm），其中葡萄糖、果糖、甘油、乙醇的測定使用示差折光檢測器，進樣量為20 μL，柱溫45 ℃，分析時間30 min；主要有機酸（酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸、乙酸）的測定采用紫外分光檢測器，進樣量為10 μL，柱溫60 ℃，分析時間30 min。

生物胺的測定[11]：取2 mL離心管，依次加入1 mol/L硼酸-硼砂緩沖液（pH 9.0）430 μL，樣品400 μL，衍生試劑（乙氧亞甲基丙二酸二乙酯600 μL和10 mL色譜純甲醇混合）300 μL，混勻后于超聲波中冰浴反應30 min，再置于75 ℃水浴條件下1.5 h以終止反應，經0.22 μm有機系尼龍濾膜過濾后進入高效液相色譜檢測。色譜柱為ZORBOX SB-C18（50 mm×3.0 mm），柱溫16 ℃，進樣量2 μL，分析時間25 min。

香氣化合物的測定[12]：使用氣相色譜儀和質譜儀進行香氣物質的測定。將5 mL發酵樣品加入到15 mL樣品瓶中，同時加入1 g NaCl、10 μL內標（4-甲基-2-戊醇）后迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子密封。將樣品瓶置于德國Gerstel多功能自動進樣系統的托盤上，系統將自動完成樣品萃取及進樣。在40 ℃下平衡30 min，待瓶中的氣-液相香氣物質達到平衡后，將已活化或熱解析過的聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB）萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，萃取頭距離液面1 cm。在40 ℃恒溫條件下攪拌萃取30 min，使樣品瓶中的香氣物質達到氣-固和氣-液平衡。然后將萃取頭插入進樣口，250 ℃熱解吸8 min，不分流進樣。載氣為高純氦氣（純度99.999%），流速：1 mL/min，自動進樣。柱溫箱升溫程序：50 ℃保持1 min，以3 ℃/min的速度升溫至220 ℃，保持5 min。質譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電子電離（electron ionization，EI）源，離子源能量70 eV，質量掃描范圍為29～350 m/z。

香氣物質的定性和定量分析：利用質譜全離子掃描圖譜，對于已有標準品的物質，依據本試驗已建立的相同色譜條件下該化合物的保留時間、保留指數和質譜信息進行定性分析，然后通過各香氣物質在模擬酒溶液中的標準曲線來進行定量。

2 結果與分析

2.1 不同劑量SO2處理葡萄后腐爛率及落果率曲線

赤霞珠葡萄果實隨儲藏時間延長，其腐爛與落果情況分別見圖1。由圖1可知，腐爛率和落果率均隨儲藏時間的延長而升高，未添加SO2保鮮劑的葡萄果實，腐爛速度和落果速度最快。添加低濃度SO2保鮮劑的葡萄果實腐爛率和落果率曲線最為平緩，前三周低濃度與高濃度SO2儲藏的葡萄差異不顯著，腐爛率和落果率約為2%～5%，但儲藏至第4周時，葡萄果實的腐爛率和落果率顯著提高，且高濃度SO2儲藏的葡萄腐爛率（13.6%）明顯高于低濃度SO2試驗組（8.2%）。以上結果表明，添加SO2保鮮劑在儲藏期內可以減緩葡萄果實腐敗，降低葡萄果實的腐爛和落果率，但是時間應該控制在3周以內。

圖1 赤霞珠葡萄在儲藏期間的腐爛率（A）和落果率（B）情況Fig.1 Decay rates(A)and drop rates(B)of Cabernet Sauvignon during storage

2.2 不同劑量SO2處理葡萄樣品酒精發酵后主代謝產物分析

酒精發酵結束后測定各試驗組葡萄酒中葡萄糖、果糖、乙醇、甘油以及有機酸（乙酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸和琥珀酸）的含量，結果見表1。

由表1可知，所有酒樣均順利完成發酵過程（還原糖總量降至4 g/L以下）。對照組（0-N）中甘油含量為7.09 g/L，隨著葡萄果實儲藏時間的延長，葡萄酒中甘油含量下降，使得葡萄酒的圓潤感下降[13]。而不同儲藏方式對葡萄酒的乙醇產量沒有顯著影響。乙酸是葡萄酒酒精發酵的副產物，GB 15037—2006《葡萄酒》中規定，葡萄酒揮發酸（以乙酸計）含量≤1.2 g/L。有研究表明，乙酸質量濃度為0.2～0.7 g/L時，對葡萄酒的香氣有積極貢獻[13]。本研究中所有樣品中乙酸含量均＜1.2 g/L，但隨著儲藏時間的延長揮發酸含量開始上升，3周后乙酸質量濃度＞0.7 g/L。揮發酸濃度增加可能是腐爛果所感染的細菌及腐敗菌引起的，添加低濃度SO2可在一定程度上抑制葡萄的腐爛，減少揮發酸的產生，但也應控制在2周之內。酒石酸是葡萄酒酸味的重要來源，參與葡萄酒味感的平衡[14]。從第2周起（除2-L），與對照相比，各個試驗組葡萄酒中酒石酸含量均顯著下降。這可能是由于處理組的葡萄醪中SO2含量較高，在發酵前期與酒石酸結合沉淀所致[14]。其他有機酸在葡萄酒中的含量無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 酒精發酵結束后各試驗組酒樣中的主代謝產物含量Table 1 Main fermentation products contents of wine samples in each treatment groups after alcoholic fermentation

2.3 不同劑量SO2處理葡萄樣品酒精和蘋乳發酵后香氣成分分析

2.3.1 香氣物質的分類分析

各試驗組中赤霞珠葡萄經過酒精發酵和蘋乳發酵后，共檢測到42種揮發性香氣物質，其中酒精發酵后重要的香氣物質見表2，蘋乳發酵后的重要香氣物質見表3。

由表2可知，高級醇是葡萄酒發酵香的重要組成成分，當其含量為250～350 mg/L時，能夠增加葡萄酒香氣的復雜性，改善其感官品質[15]。本試驗所有樣品的高級醇含量均低于350mg/L，能夠一定程度上增加了葡萄酒香氣的復雜性。其中，對照組高級醇含量最高（348.19 mg/L），而儲藏2周后的各試驗組中高級醇含量均＜300 mg/L。苯乙醇具有令人愉快的玫瑰和蜂蜜香氣[16]，對葡萄酒的香氣輪廓具有積極作用。對照組及儲藏1周的葡萄酒樣品中（除1-N外），苯乙醇含量均＞100 mg/L，使得葡萄酒的花香和甜香更為濃郁。但是隨著儲藏時間的延長，苯乙醇的含量會出現不同程度的下降，不利于葡萄酒的香氣品質提升。

酯類物質是葡萄酒中僅次于高級醇的第二大類揮發性物質，這類物質對葡萄酒的果香具有重要的貢獻[17]。高濃度SO2處理會促使葡萄酒中乙酸乙酯含量升高，儲藏1周后乙酸乙酯含量為107.8 mg/L，是對照組0-N（80.7 mg/L）的1.34倍。而儲藏4周后，葡萄酒中乙酸乙酯的含量達到152.9 mg/L，是對照組的1.89倍，這會掩蓋葡萄酒本身水果類香氣，對葡萄酒產生負面影響[18]。低濃度SO2處理的酒樣在第2周時乙酸乙酯含量為78.9 mg/L，但從第3周起，含量明顯上升，為110.6～163.1 mg/L。表明即便添加二氧化硫保鮮劑能夠一定程度的抑制葡萄的腐爛，但是長時間儲藏依舊會導致乙酸乙酯含量的顯著升高，對葡萄酒的最終品質帶來不利影響。此外，隨著葡萄果實儲藏時間的延長，葡萄酒中乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯的含量有所增加，并且高濃度的SO2處理的試驗組比低濃度試驗組更能夠促進上述酯類物質的積累，可能是由于二氧化硫抑制了其他雜菌的生長，導致釀酒酵母產酯代謝的增強。

由表3可知，蘋乳發酵結束后，各試驗組的香氣物質出現了不同程度的下降，但是大體趨勢與酒精發酵相一致。綜上所述，隨著儲藏時間的延長，高級醇類物質明顯下降，而大多數酯類物質的含量有所上升。添加高濃度的二氧化硫保鮮劑能夠提高一些重要酯類物質的含量，如乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等，但是卻會導致乙酸乙酯含量的超過閾值，進而為葡萄酒帶來一些負面的影響。

2.3.2 香氣物質的主成分分析

對各試驗組酒精及蘋乳發酵后的香氣物質情況進行主成分分析（principal component analysis，PCA）以揭示各試驗組之間的差異見圖2。由圖2可知，酒精發酵結束后，對照組（0-N）位于第三象限，而其他處理組均位于第一、二、四象限，這表明酒精發酵后不同試驗組與對照組的香氣輪廓有明顯的差異。對照組位于PC1和PC2的負半軸，與香茅醇、異丁醇和苯酚密切相關。而高濃度二氧化硫處理的試驗組（除4-H外）與大部分酯類物質和脂肪酸類物質相關性較強，能為葡萄酒提供香蕉味、玫瑰花香、蘋果味、草莓味等令人愉快的花香果香氣味，并增加葡萄酒香氣的復雜性[19]。蘋乳發酵結束后，對照組（1-N）與試驗組1-N和1-L均位于第四象限，與己酸乙酯、己酸、1-己醇密切相關。而其他試驗組（除2-L和2-N外）具有相似的香氣輪廓，與乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸甲酯等物質相關性較強。上述結果表明，隨著儲藏時間的延長，葡萄酒的香氣輪廓發生了變化。當儲藏時間超過三周后，試驗組的香氣物質與對照組差別明顯，而儲藏1周對香氣物質的影響最小。

圖2 酒精發酵（A）和蘋乳發酵（B）后香氣物質主成分分析Fig.2 Principal components analysis of aroma compounds in wine samples after alcoholic fermentation(A)and malolactic fermentation(B)

2.3.3 香氣物質雙因素方差分析

以上結果表明，SO2濃度（F1）和儲藏時間（F2）是造成干紅葡萄酒香氣物質含量差異的兩個主要因素。采用雙因素方差分析（two-way variance analysis）進一步探究哪種因素對香氣含量的影響更為顯著。

雙因素方差分析表明，SO2添加濃度和儲藏時間對以下香氣物質變化有顯著的協同作用（P＜0.01）：異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、辛酸異戊酯、癸醛。而儲藏時間對13種香氣物質產生顯著性影響見表4。由表4可知，從F值大小可以看出儲藏時間對香氣物質的影響比SO2濃度更加顯著，如：乙酸異戊酯含量受SO2濃度和儲藏時間的影響均顯著（P＜0.001），但儲藏時間的影響更大（F1=24.716，F2=47.024）。蘋乳發酵后的結果與酒精發酵后相似。以上結果表明儲藏釀酒葡萄時，SO2添加濃度和儲藏時間會顯著影響葡萄酒的香氣品質，其中儲藏時間影響更大。因此，在優化SO2添加濃度的同時，應嚴格控制儲藏時間。

表4 不同試驗組中酒精發酵及蘋乳發酵結束后酒樣中香氣物質的雙因素方差分析Table 4 Two-way variance analysis of aroma compounds of wine samples in different treatment groups after alcoholic fermentation and malolactic fermentation

2.4 不同劑量SO2處理葡萄樣品酒精發酵和蘋乳發酵后生物胺含量

生物胺是葡萄酒發酵過程中的一類發酵副產物，其含量高低直接決定了葡萄酒的安全品質[19]。葡萄酒中的生物胺一部分來自于葡萄果實本身，另一部分則是發酵過程中由微生物對游離氨基酸脫羧產生[20]。本研究共檢測到8種生物胺，包括乙醇胺、組胺、酪胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、精胺和亞精胺。酒精發酵以及蘋乳發酵后各個酒樣中生物胺含量分別見表5和表6。

表5 酒精發酵結束后葡萄酒中生物胺含量Table 5 Biogenic amines contents in wines after alcoholic fermentation

由表5可知，葡萄儲藏時間在一周之內的試驗組中組胺的含量最低（0.7 mg/L），而隨著儲藏時間的增加，大部分試驗組中組胺的含量會有不同程度的增加（4.0～5.7 mg/L）。酒精發酵后，對照組（0-N）的生物胺總量為36.3 mg/L，而儲藏1～4周的試驗組中生物胺的含量均高于對照組，其中試驗組4-H的生物胺總量最高，是對照組的1.46倍。這說明釀酒葡萄經過儲藏后可能會增加葡萄酒中生物胺含量，進而導致葡萄酒的安全性產生不利影響。相比于高濃度SO2試驗組，添加低濃度的SO2的能夠一定程度上控制生物胺的升高，對果實儲藏后的葡萄酒品質有積極作用。由表6可知，蘋乳發酵后各試驗組中生物胺含量都有不同程度的升高，其中4-H試驗組蘋乳發酵后（22.4mg/L）組胺的含量是酒精發酵后（5.4 mg/L）的4.1倍。而儲藏時間在1周之內的試驗組組胺的含量與對照組相似。因此，從葡萄酒的安全性角度考慮，葡萄儲藏的時間應該盡量控制在1周之內，添加低濃度的SO2能夠一定程度上降低葡萄酒生物胺的含量，具體的機制還需要進一步研究。

表6 蘋乳發酵結束后葡萄酒中生物胺含量Table 6 Biogenic amines contents in wines after malolactic fermentation

3 結論

本研究以健康、成熟的赤霞珠葡萄為原料，在低溫條件下（4 ℃），采用不同濃度SO2保鮮劑處理不同時間后將葡萄按照常規工藝進行酒精和蘋乳發酵，研究SO2保鮮劑預處理對葡萄酒香氣和生物胺含量的影響。研究結果表明，低溫條件下，添加低濃度和高濃度的SO2均能夠降低約4%葡萄腐爛率（3周之內）。儲藏時間對葡萄酒香氣品質影響最大，延長儲藏時間會導致葡萄酒香氣品質下降。除此之外，添加高濃度的二氧化硫還能夠一定程度上增加葡萄酒中苯乙醇、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯的含量，為葡萄酒帶來令人愉悅的花香和果香，增加葡萄酒香氣的復雜性，但是會導致乙酸乙酯增加，對葡萄酒香氣品質帶來負面作用。果實儲藏后各試驗組中組胺和生物胺總量均有所升高（與對照相比），其中低濃度SO2試驗組中組胺和生物胺含量最低，能夠一定程度上保證葡萄酒的安全品質。綜上所述，可以得出以下結論：在低溫條件下（4 ℃），通過SO2保鮮劑預處理能夠在一定時間內保證釀酒葡萄的釀造品質，但儲藏時間應盡量縮短（控制在1周之內）。