發酵型黃精米酒動力學及抗氧化性研究

汪 濤，裴海生，王民敬，胡雪芳，唐維媛，張志民

（1.農業農村部規劃設計研究院 農產品加工工程研究所，北京 100121；2.農業農村部農產品產后處理重點實驗室，北京 100121；3.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴陽 550025；4.貴州理工學院，貴陽 550003）

黃精（Polygonatum sibiricum）又名雞頭黃精，我國首批進入食藥同源的品種，黃精富含活性多糖、黃酮類化合物、多酚類化合物、甾體皂苷、蒽醌類化合物、生物堿和多種人體有用氨基酸類化合物[1]。經研究，黃精在治療疲勞、降血糖、提高免疫和緩解性功能障礙等方面均有很好的療效[2-4]。李錦松等[5]研究發現，黃精有助于釀酒酵母的生長，并能提高黃酒的產酒率和體外抗氧化能力。

發酵動力學主要是研究微生物生長、產物生成及底物消耗隨發酵時間的變化規律構建適合的數學模型，并通過模型對發酵生產進行工藝控制、定量分析和各項指標的準確預測；還可以通過模型預判發酵初期出現的異常情況，對過渡到工業發酵具有實際的指導意義[6-8]。李秀萍等[9]采用Logistic和Leudeking-Piret模型，構建甘蔗果酒發酵過程中酵母菌生長、酒精生成及底物消耗動力學模型，擬合度R2分別為0.983 2、0.972 4和0.972 1，能準確模擬甘蔗果酒的發酵過程，有利于其工業化生產。蔣艾廷等[10]采用Matlab軟件對一株優選釀酒酵母構建發酵動力模型，對發酵過程中微生物數量的變化和葡萄糖的消耗分別進行非線性擬合，擬合度R2分別為0.997 2和0.978 4，擬合效果較好，說明擬合模型能很好的描述該菌的發酵過程。

目前，發酵型黃精米酒的研究主要集中在發酵工藝方面，陶濤[11]運用響應面法研究發酵型黃精米酒加工工藝；梁安怡[12]通過正交試驗優選出發酵型黃精米酒的最佳釀制條件。但關于發酵型黃精米酒在發酵過程中酵母菌生長、酒精生成及殘糖消耗動力學特征方面的研究鮮有報道。本試驗采用經典的“S”曲線模型對發酵型黃精米酒發酵過程中酵母菌含量變化、酒精生成及殘糖消耗進行非線性擬合，構建發酵動力學模型。測定發酵過程中總酚和總黃酮含量的變化，同時結合總抗氧化能力試劑盒法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法和鄰苯三酚自氧化物法探討不同發酵時間發酵型黃精米酒的抗氧化性。通過對發酵型黃精米酒動力學及抗氧化性的研究分析，為后期工業生產和產品的定位提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精（Polygonatum sibiricum）：遼寧澳地森生物工程有限公司；圓江糯米：盤錦大米集團；釀酒酵母：中國食品發酵工業研究院；酒曲：雅大科技實業有限公司。

麥芽汁培養基：青島高科技工業園海博覽生物技術有限公司；亞鐵氰化鉀、沒食子酸標準品、蘆丁標準品、鄰苯三酚、DPPH自由基（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

CH-270LFJG-00米酒發酵罐：上海承歡輕工機械有限公司；酒精計：廣州市銘睿電子科技有限公司；LDZX-50KBS立體式高壓滅菌器：上海申安醫療器械廠；RE-2000A旋轉蒸發器：西安喬普生物科技有限公司；HZQ-C空氣浴振蕩器：東聯電子技術開發技術有限公司；PB-10 酸度計：杭州微米派科技有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵型黃精米酒工藝流程

糯米汽蒸后冷卻至常溫，添加0.6%酒曲糖化24 h后，接種2%釀酒酵母并加入7%的黃精粉發酵，28 ℃進行主發酵6 d，結束后將溫度降至15 ℃進入后發酵14 d。主發酵每隔1 d取樣，后發酵每隔2 d取樣。

1.3.2 發酵動力學指標測定方法

菌含量：細胞干質量法[7]；酒精度、殘糖含量按GB/T 13662—2008《黃酒》測定[13]。

1.3.3 總酚、總黃酮含量的測定

總酚含量：采用Folin-Ciocalteu法[14]測定；沒食子酸標準曲線回歸方程：y=0.845 8x+0.034 2，R2=0.999 5。

總黃酮含量：采用分光光度法[14]測定；蘆丁標準曲線回歸方程：y=0.299 6x+0.021 7，R2=0.999 3。

1.3.4 總抗氧化能力的測定

按照總抗氧化能力測定試劑盒法[15]操作步驟測定總抗氧化能力。按下式計算總抗氧化能力：

1.3.5 O2-·清除率的測定

取1.0 mL樣品與5.0 mL Tris-HCl溶液（pH8.2）混勻，25 ℃水浴20 min后加入0.05 mol/L鄰苯三酚溶液1.0 mL，搖勻，25℃水浴5 min，加入濃鹽酸1.0 mL終止反應，蒸餾水調零，在波長325nm處測定樣品吸光度值[16]。按下式計算O2-·清除率。

式中：A0為蒸餾水代替樣品的吸光度值；Ax0為蒸餾水代替鄰苯三酚的吸光度值；Ax為樣品的吸光度值。

1.3.6 DPPH自由基清除率的測定

取2.0 mL樣品與2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混勻，暗反應30 min，蒸餾水調零，在波長517 nm處測定吸光度值（Ax）；同樣測定2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液與2.0 mL體積分數70%的乙醇溶液的吸光度值（A0）；以及2.0 mL樣品與體積分數70%的乙醇溶液的吸光度值（Ax0）[17]。按下式計算DPPH自由基清除率。

1.3.7 數據處理與分析

采用Origin 2017軟件對實驗數據作圖分析，選取典型“S”曲線模型對酵母菌含量、酒精度及殘糖含量進行非線性擬合，選擬合度R2大的數學模型描述其發酵動力學特征，并應用SPSS 19.0軟件對最佳模型預測值與實驗值進行T顯著性檢驗。應用Origin 2017軟件對發酵過程中總酚含量、總黃酮含量及抗氧化性變化進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中酵母菌含量、酒精度及殘糖含量的變化情況

由圖1可知，酵母菌在發酵1～4 d經歷遲滿滯期和對數期，菌體含量大幅度增加。發酵4～6 d酵母菌增殖進入穩定期，菌體含量最大為21.9 g/L。發酵6 d后酵母菌進入衰亡期，菌體含量開始減少，主要原因是隨著發酵時間的延長，還原糖快速消耗，酒精度快速上升，菌體出現自溶和沉淀；另外，發酵性糖的轉化，使發酵醪液的滲透壓升高，嚴重抑制酵母菌的代謝[18]。酒精度在發酵1～6 d增長速度較快，發酵6 d后，酒精度增加極其緩慢基本趨于穩定，酒精度最高為11.4%vol。由于酵母菌將殘糖轉化為酒精及合成自身所需要的能量物質，殘糖含量逐漸降低，發酵1～6 d降低速度較快；到6 d后因為酵母菌的衰老和數量的減少，殘糖含量基本穩定在較低的水平。

圖1 發酵過程中酵母菌含量、酒精度及殘糖含量的變化趨勢Fig.1 Change trends of yeast number,alcohol content and residual sugar content during fermentation process

2.2 發酵型黃精米酒動力學模型

2.2.1 酵母菌生長動力學模型

對發酵1～6 d酵母菌生長情況進行非線性擬合，通過SGompertz模型、DoseResp模型和Logistic模型進行擬合，結果見表1。由表1可知，擬合度R2分別為0.936 7、0.997 5和0.992 5，故選DoseResp模型對酵母菌生長進行擬合，擬合曲線如圖2所示。

表1 酵母菌含量擬合方程及R2值Table 1 Fitting equation of yeast number and R2 value

圖2 DoseResp模型下酵母菌生長擬合曲線Fig.2 Fitting curve of yeast growth with DoseResp model

由表2可知，在置信區間95%，顯著水平α=0.05時，t1（0.05）=0.496 7，檢驗值T1=-0.008 2＜t1（0.05），說明預測值與實驗值不存在顯著性差異（P＞0.05），DoseResp模型能很好的模擬發酵過程中酵母菌生長情況。

表2 酵母菌生長模型預測值與實驗值T檢驗結果Table 2 Comparison of model and experimental values for yeast growth by T test results

2.2.2 酒精生成動力學模型

通過Boltzmann模型、DoseResp模型和Logistic模型對發酵過程中酒精生成進行非線性擬合，如表3所示。由表3可知，擬合度R2分別為0.995 3、0.995 3和0.990 6，故選Boltzmann模型和DoseResp模型對酒精生成進行擬合，擬合曲線如圖3和圖4所示。

表3 酒精生成擬合方程及R2值Table 3 Fitting equation of alcohol formation and R2 value

圖3 Boltzmann模型下酒精生成擬合曲線Fig.3 Fitting curve of alcohol formation with Boltzmann model

圖4 DoseResp模型下酒精生成擬合曲線Fig.4 Fitting curve of alcohol formation with DoseResp model

表4 酒精生成模型預測值與實驗值T檢驗結果Table 4 Comparison of model and experimental values for alcohol formation by T test results

由表4可知，在置信區間95%，顯著水平α=0.05時，t2（0.05）=0.477 3，檢驗值T2=-0.058 1＜t2（0.05），檢驗值T3=1.113 6E-5＜t2（0.05），說明兩模型預測值與實驗值不存在顯著性差異（P＞0.05），Boltzmann模型與DoseResp模型均能很好的模擬發酵過程中酒精生成情況。

2.2.3 殘糖消耗動力學模型

通過Boltzmann模型，DoseResp模型和Logistic模型對發酵過程中殘糖消耗進行非線性擬合，如表5所示。由表5可知，擬合度R2分別為0.993 2、0.993 2和0.982 7，故選Boltzmann模型和DoseResp模型對殘糖消耗進行擬合，擬合曲線如圖5和圖6所示。

表5 殘糖消耗擬合方程及R2值Table 5 Fitting equation of residual sugar consumption and R2 value

圖5 Boltzmann模型下殘糖消耗擬合曲線Fig.5 Fitting curve of residual sugar consumption with Boltzmann model

由表6可知，在置信區間95%，顯著水平α=0.05時，t3（0.05）=0.5，檢驗值T4=-1.70146E-5＜t3（0.05），檢驗值T5=-0.023 3＜t3（0.05），說明兩模型預測值與實驗值不存在顯著性差異（P＞0.05），Boltzmann模型與DoseResp模型均能很好的模擬發酵過程中殘糖消耗情況。

圖6 DoseResp模型下殘糖消耗擬合曲線Fig.6 Fitting curve of residual sugar consumption with DoseResp model

表6 殘糖消耗模型預測值與實驗值T檢驗結果Table 6 T test results of model and experimental values for residual sugar consumption

2.3 發酵過程中總酚、總黃酮含量的變化情況

圖7 發酵過程中總酚含量的變化趨勢Fig.7 Change trends of total phenols contents during fermentation process

由圖7可知，總酚含量呈先增加后降低并緩慢趨于穩定的趨勢，一方面是因為隨著發酵的進行酒精度不斷的上升，且酚類物質易溶于有機溶劑；另一方面可能是酚類化合物在發酵液中發生了氧化和降解反應[19]。發酵1～6 d期間總酚含量呈上升趨勢，最高含量達4.87 mg/mL；發酵6 d后總酚含量開始降低并趨于穩定，發酵結束時總酚含量顯著高于發酵初始水平（P＜0.05）。

由圖8可知，總黃酮含量總體較低，變化趨勢與總酚含量類似。主發酵期間總黃酮含量快速增長，發酵8 d時總黃酮含量最大為0.34 mg/mL，發酵8 d后呈下降趨勢直至穩定。主發酵階段總黃酮含量增加較快，與酒精含量的增加趨勢基本吻合，原因是酒精有助于黃酮類化合物的溶出；后發酵階段總黃酮含量的降低主要是因為酵母菌代謝的次級代謝產物與黃酮類物質發生反應生成大分子的衍生物，此外發酵過程中一些不穩定的類黃酮化合物會降解成分子量較小的酚單元[19-20]。

圖8 發酵過程中總黃酮含量的變化趨勢Fig.8 Change trends of total flavonoids contents during fermentation process

2.4 發酵過程中抗氧化性的變化情況

2.4.1 發酵過程中總抗氧化能力的變化趨勢

圖9 發酵過程中總抗氧化能力的變化趨勢Fig.9 Change trends of total antioxidant capacity during fermentation process

由圖9可知，總抗氧化能力呈先增加后降低的變化趨勢，總抗氧化能力與總酚、總黃酮含量的變化趨勢相對應，發酵到第6天時總抗氧化能力最大為63.43單位/mL，發酵6 d后由于總酚、總黃酮等抗氧化活性成分含量的降低，總抗氧化能力也隨之下降[21]。

2.4.2 發酵過程中O2-·和DPPH·清除率的變化趨勢

圖10 發酵過程中O2-·和DPPH·清除率的變化趨勢Fig.10 Change trends of O2-·and DPPH·svavenging rates during fermentation process

由圖10可知，O2-·和DPPH·清除率均為先增加后降低的變化趨勢，總體變化不顯著（P＞0.05）。隨著發酵的進行抗氧化物質浸出增多，O2-·和DPPH·清除率也相應的增加，發酵第3天時DPPH·清除率最高為95.53%，第6天時O2-·清除率最高為67.36%；繼續發酵后，自由基清除率開始下降。

3 結論

采用Boltzmann模型和DoseResp模型對發酵型黃精米酒在發酵過程中酵母菌生長、酒精生成和殘糖消耗進行非線性擬合，同時對模型預測值和實驗值進行T顯著性檢驗，T檢驗結果均不顯著（P＞0.05），說明所選擬合方程能夠很好的模擬發酵過程及描述其動力學特征；發酵過程中總酚含量、總黃酮含量、總抗氧化能力、O2-·和DPPH·清除率均呈現先增加后降低并趨于穩定的趨勢，在主發酵階段呈上升趨勢，后發酵階段呈下降趨于穩定的趨勢。通過對發酵型黃精米酒動力學及抗氧化性研究，可以為后期工業生產和產品定位提供理論指導。