新疆發酵駝乳中分解植酸鹽酵母菌的篩選及鑒定

王建程，李 珊，劉 月，李王強，李寶坤

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000）

植酸是一種天然有機化合物，主要存在于豆類、谷類等一些種子的胚芽組織中，螯合金屬離子為植酸鹽[1-2]。植酸酶是一類可分解植酸或植酸鹽生成肌醇和磷酸的酶類。植酸酶根據來源可分為動物植酸酶、植物植酸酶和微生物植酸酶[3]。前兩類植酸酶存在活力低和穩定性差的問題，而微生物植酸酶易生產、活力高和穩定，應用最廣、研究最深入。研究發現產植酸酶的微生物包括細菌（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和乳桿菌等）、酵母菌（啤酒酵母和畢赤酵母等）和真菌（曲霉、根霉和毛霉）。

植酸酶目前主要用于飼料添加劑，其在食品工業中的研究較少。由于人和單胃動物缺乏分解植酸鹽的植酸酶，植酸鹽與腸道內物質如蛋白質和礦物質反應，不僅降低單胃動物對磷等金屬離子的吸收和利用，還影響蛋白質等營養物質的消化吸收，因此，使用植酸酶降低食品中植酸鹽含量有重要的研究價值。目前，食品用植酸酶主要由基因工程構建的真菌產生，這類酶對熱敏感，在高溫條件下易不可逆失活，所以增加腸道中可分解植酸鹽的微生物對營養物質的吸收有重要的補充意義。發酵乳品是篩選分解植酸鹽益生菌的寶貴資源庫，富含大量可分解植酸鹽的酵母菌，如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）和庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）等[4-5]。GREPPI A等[6]從發酵乳品中篩選到一株庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），其胞外植酸酶酶活性可達49.17 mU/mL，具有應用潛力。我國《可用于保健食品的真菌名單》包含釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、產朊假絲酵母（Cadida atilis）和乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis），而在許多工業發酵或者自發酵食物中存在眾多不在名單中的酵母菌種[4-5，7-8]。在此背景下，發酵食物是一個攝入酵母菌的重要途徑。

為發掘和保護新疆牧區傳統發酵駝乳中的益生酵母菌資源，本研究以新疆伊犁地區不同牧區的12份發酵駝乳為原料，采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基分離，富含植酸二鉀的培養基初篩及降解植酸鹽能力的測定從中篩選可降解植酸鹽的酵母菌，通過形態觀察、生理生化試驗及5.8S rDNA ITS1/ITS4區域序列同源性分析鑒定菌種，并測定其耐酸及耐膽鹽性能。以期篩選到具有降解植酸鹽的酵母菌，為后期在發酵食品中的應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

12份發酵駝乳樣品：采集自新疆伊犁州國營牧場、巴音傲瓦鄉牧區、伊克烏圖布拉格牧場、精河小海子牧區、精河闊岱管護站牧區，均是哈薩克族、蒙古族和維吾爾族牧民采用傳統方法發酵而成。

1.1.2 試劑

膽鹽、植酸二鉀、胃蛋白酶、硝酸鉀、亞硝酸鈉（均為分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、D-半乳糖、棉子糖、可溶性淀粉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

YPD培養基[9]：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，121 ℃高壓滅菌15 min。

Phy+培養基[10]：葡萄糖20 g/L，氯化鉀1.7 g/L，硫酸二胺7.5 g/L，七水硫酸鎂0.74 g/L，植酸二鉀1.85 g/L，121 ℃高壓滅菌15 min。

Phy-培養基[10]：葡萄糖20 g/L，氯化鉀1.7 g/L，硫酸二胺7.5 g/L，七水硫酸鎂0.74 g/L，121 ℃高壓滅菌15 min。

Phy基礎培養基[10]：葡萄糖20 g/L，磷酸二氫鉀3.5 g/L，硫酸二胺7.5g/L，七水硫酸鎂0.74g/L，121℃高壓滅菌15min。

以上為液體培養基，固體培養基添加20 g/L的瓊脂粉。

1.2 儀器與設備

W-CJ-1CG超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DNP-9272電熱恒溫培養箱：上海精宏試驗設備公司；5417R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；TC-512聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：美國Techne公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；722S可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的分離純化

取500 μL發酵駝乳于4.5 mL無菌生理鹽水中，按10倍梯度進行稀釋，均勻涂布于YPD培養基，在28 ℃條件下培養48 h，觀察并記錄菌落特征，挑取單個菌落進行美蘭染色，鏡檢，觀察并記錄細胞形態，將不同形態的酵母菌重復劃線純化，直至形態單一，保存在30%的甘油中，-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3.2 分解植酸鹽酵母菌的篩選[6]

菌株的活化：將甘油管中的酵母菌在YPD固體培養基上劃線活化，28 ℃條件下培養48 h，連續活化三代至長勢良好。

種子液的制備：將活化好的單菌落接種于5mLYPD液體培養基中，28 ℃、150 r/min條件下培養24 h；按2%（V/V）的接種量接種于50 mL YPD液體培養基中，28 ℃、150 r/min條件下培養24 h得到種子液。

按2%（V/V）的接種量將種子液接種于YPD液體培養基中，28 ℃、150 r/min條件下培養24 h，4 ℃條件下經5 000×g離心10 min，收集菌泥，無菌生理鹽水清洗3次后，用無菌生理鹽水重懸。按2%（V/V）的接種量將菌種重懸液分別接種于YPD液體培養基、Phy+液體培養基及Phy-液體培養基，于28 ℃、150 r/min條件下培養24 h，采用分光光度計調整培養液的OD600nm值=0.1；將菌種重懸液梯度稀釋，吸取100 μL分別涂布于YPD固體培養基、Phy+固體培養基及Phy-固體培養基，于28 ℃條件下培養，三種培養基中均生長的菌株為可分解植酸鹽的酵母菌。

1.3.3 分解植酸鹽能力的測定

將篩選得到的酵母菌的種子液按2%（V/V）的接種量接種于Phy液體基礎培養基中，28 ℃、150 r/min條件下培養。用Phy液體基礎培養基將培養液具體濃度稀釋到108CFU/mL，吸取100 μL于Phy+固體培養基中的牛津杯中，在28 ℃條件下培養，采用游標卡尺分別測定培養24 h和48 h的透明圈直徑。透明圈直徑＞1 cm被認為具有分解植酸鹽的能力[6]。

1.3.4 菌株的鑒定

（1）形態觀察[11]

對篩選菌株的菌落形態、細胞形態、繁殖方式進行觀察。

（2）生理生化試驗[11]

通過糖發酵試驗、碳源同化試驗、氮源同化試驗、類淀粉化合物生成試驗、產酯試驗、產酸試驗等生理生化特征對篩選菌株進行鑒定。

（3）分子生物學鑒定[12-13]

將篩選得到的菌株接種于YPD液體培養基中，28 ℃條件下培養36 h，取1 mL菌液，12 000 r/min離心1 min，收集菌泥，采用酵母菌基因組脫氧核糖酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（離心柱型）提取DNA。以基因組DNA為模板，使用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對菌株的5.8 S rDNA ITS區域序列進行PCR擴增。PCR擴增體系：DNA模板2 μL，ITS 1（10 μmol/L）2 μL，ITS 4（10 μmol/L）2 μL，2×TaqPCR MasterMix 25 μL，加雙蒸水（ddH2O）補充至50 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共36個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果在美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫進行BLAST比對，選取同源性較高的模式菌株的5.8 SrDNAITS區域序列，采用MEGA軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.5 菌株耐酸耐膽鹽能力的測定[14]

按照2%（V/V）的接種量將種子液接種于YPD液體培養基中，28 ℃、150 r/min條件下培養24 h至對數期末期形成菌種原液。將200 μL制備好的菌種原液分別加入pH 4.0和含0.3%膽鹽的10 mL YPD液體培養中，混勻后置于28 ℃、150 r/min條件下培養，分別在培養2 h、4 h后取出，菌種原液中活菌數為初始菌落，使用平板計數法測得菌落數，并計算存活率，其計算公式如下：

式中：N0為初始菌落數，CFU/mL；N1和N2分別是模擬胃液2 h和模擬腸液4 h后的菌落數，CFU/mL。

2 結果與分析

2.1 分解植酸鹽酵母菌的分離和篩選

通過YPD培養基從12份發酵駝乳中共分離純化得到284株酵母菌，通過Phy+培養基及Phy-培養基初步篩選得到15株可分解植酸鹽的酵母菌，菌株編號分別為D7-10、DW1-1、D7-6、G1-16、DY1-13、G1-10、TY1-2、BJ9-4、BJ9-5、BJ9-12、DY1-2、TS1-1、TXMY1-2、B13-3和H1-3。

2.2 分解植酸鹽能力的測定

對15株酵母菌分解植酸鹽的能力進行測定。結果見圖1。

圖1 15株酵母菌分解植酸鹽能力的測定結果Fig.1 Determination results of phytate degradation ability of 15 strains of yeast

由圖1可知，除酵母菌B13-3、DW1-1、TXMY1-2和TY1-2不能形成透明圈外，其余酵母菌都可形成透明圈，且培養48 h時的透明直徑顯著大于24 h的透明圈直徑（P＜0.01），其中酵母菌H1-3僅在培養48 h時才形成透明圈。在培養48 h時，各酵母菌的透明圈直徑差異不顯著（P＞0.05）。結果表明，可分解植酸鹽的酵母菌有11株。

2.3 可分解植酸鹽酵母菌株的鑒定

2.3.1 形態觀察及生理生化試驗結果

11株可分解植酸鹽酵母菌株的菌落形態、細胞形態、繁殖方式見表1，生理生化試驗結果見圖2。

表1 11株酵母菌菌株的形態觀察結果Table 1 Results of morphology observation of 11 strains of yeast

由表1可知，除菌株H1-3外，其余10株酵母菌的菌落均為乳白色，表面干燥，而菌株H1-3的菌落為乳黃色且表面光滑；大部分菌株菌落邊緣整齊，少數菌株呈不規則圓形；大部分菌株細胞形態呈橢圓，少數呈棒狀；繁殖方式為裂殖或芽殖。

圖2 11株酵母菌生理生化試驗結果Fig.2 Results of physiological and biochemical tests of 11 strains of yeast

由圖2可知，所有菌株不可發酵麥芽糖、不可同化硝酸鉀和亞硝酸鈉；除菌株H1-3外，其余菌株不可發酵葡萄糖、蔗糖、乳糖，不可同化蔗糖、乳糖、麥芽糖和棉子糖。

結合表1酵母菌的菌落形態和圖2生理生化試驗鑒定結果，并查閱《酵母菌的特征與鑒定手冊》[13]，初步將分離到的11株菌株歸屬于3個不同的屬，即酵母菌D7-10、D7-6、G1-16、DY1-13、G1-10、BJ9-4、BJ9-12和TS1-1為畢赤酵母屬（Pichia）；酵母菌H1-3為克魯維酵母屬（Kluyveromyces）；酵母菌BJ9-5、DY1-2為地霉屬（Geotrichum）。

2.3.2 分子生物學鑒定結果

11株可分解植酸鹽的酵母菌的系統發育樹見圖3。

圖3 基于5.8S rDNA ITS1/ITS2區域序列11株菌株的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 11 strains based on 5.8S rDNA ITS1/ITS2 regional sequences

由圖3可知，菌株D7-10、D7-6、G1-16、DY1-13、G1-10、BJ9-4、BJ9-12和TS1-1均與庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）聚于一支，親緣關系最近；菌株BJ9-5和DY1-2均與白地霉（Geotrichum candidum）聚于一支，親緣關系最近；菌株H1-3與乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）聚于一支，親緣關系最近。結合形態觀察及生理生化試驗結果，鑒定菌株D7-10、D7-6、G1-16、DY1-13、G1-10、BJ9-4、BJ9-12、TS1-1均為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），菌株BJ9-5、DY1-2均為白地霉（Geotrichum candidum），菌株H1-3為乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）。乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）在我國《可用于保健食品的真菌菌種名單》中。庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）也稱為東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），可用于發酵面團、酒和醋等[15-16]；白地霉（Geotrichum candidum）在制作霉菌成熟干酪時可作為次級發酵劑分解酯類和酪蛋白形成獨特風味[17]，美國食品藥品監督管理（food and drug administration，FDA）規定這些酵母為一般認為安全（generally recognized as safe，GRAS）[18]。

2.4 分解植酸鹽菌株耐酸耐膽鹽能力測定

隨發酵食品入腸道后，酵母存活、分解植酸鹽，需要耐受胃（極酸）和/或腸（高膽鹽）環境。11株分解植酸鹽酵母菌株的耐酸存活率與耐膽鹽存活率見表2。

表2 11株酵母菌株的存活率Table 2 Survival rates of 11 strains of yeast

由表2可知，11株菌株對模擬胃腸道的極端環境都具有耐受性，耐酸存活率為24.00%～87.89%，耐0.3%膽鹽存活率為40.25%～109.54%。其中菌株BJ9-12在酸和0.3%膽鹽脅迫下存活率分別達到87.79%和81.50%，具有良好的耐酸耐膽鹽能力；菌株D7-6和DY1-2在膽鹽脅迫下正常生長，具有很強的膽鹽耐受性。

迪娜熱爾·迪力達西等[7]從新疆傳統發酵乳制品乳酪乳清中分離出的東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）在模擬人工胃液中存活率達到132.22%，乙醇假絲酵母（Candida ethanolica）在模擬腸液中存活率達到101.27%。肖新云等[19]研究發現，漢遜德巴利酵母菌（Debaryomyces hansenii）在pH 1.5和0.4%膽鹽下仍然能夠存活，并且在模擬人工胃腸液下，該菌并沒有被抑制反而能夠適應性生長繁殖；而一株伯頓畢赤酵母菌（Pichia burtonii）在人工胃液環境（pH 1.5）培養4 h后存活率達到42.78%[20]。在本研究中8株畢赤庫德酵母菌只有菌株BJ9-12在耐酸耐膽鹽能力較為突出可見。可見不同種的酵母菌或者同種不同株的酵母菌耐受胃腸環境脅迫能力呈株特異性。

3 結論

利用植酸二鉀培養基和植酸鹽透明圈篩選出11株可分解植酸鹽的酵母菌，經形態觀察、生理生化試驗及分子生物學鑒定8株為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），2株為白地霉（Geotrichum candidum），1株為乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）。其中，庫德畢赤酵母BJ9-12在模擬胃液和腸液中的存活率分別為87.79%和81.50%，培養48 h時，分解植酸鹽的透明圈直徑為3.45 cm，在發酵食品中具有良好的應用潛力。