組成型分泌表達(dá)嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶的重組糞腸球菌的構(gòu)建

曾 靜，袁 林*，郭建軍，魏國汶

（江西省科學(xué)院 微生物研究所，江西 南昌 330096）

淀粉廣泛存在于谷物類飼料中，是大多數(shù)畜禽所需能量的主要來源之一[1]。淀粉酶是催化淀粉水解成葡萄糖、麥芽糖及糊精一類酶的總稱[2]。在動物生產(chǎn)行業(yè)中，淀粉酶主要作為飼料添加劑被添加到動物飼料中，以彌補(bǔ)動物體內(nèi)淀粉酶的不足，從而提高飼料利用率，降低養(yǎng)殖成本，減少養(yǎng)殖環(huán)境的污染[3-4]。但是淀粉酶作為蛋白質(zhì)類生物大分子，易受飼料加工制粒、貯藏等因素影響而失活[3-4]。

乳酸菌是一群革蘭氏陽性、能夠發(fā)酵碳水化合物、以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的各類細(xì)菌統(tǒng)稱，是人與大多數(shù)動物腸道內(nèi)的常見優(yōu)勢菌群，被公認(rèn)為安全級微生物[5-8]。乳酸菌是使用得最廣泛的一類益生菌。此外，雖然與其他原核表達(dá)系統(tǒng)（如大腸桿菌（Escherichia coli）表達(dá)系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）表達(dá)系統(tǒng)等）相比，乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的研究和開發(fā)較晚，但是隨著人們對乳酸菌各類表達(dá)調(diào)控元件的不斷研究，陸續(xù)研發(fā)出了適用于乳酸菌的多種載體，如克隆載體、表達(dá)載體（分泌型表達(dá)載體、組成型表達(dá)載體）、整合載體等，使得乳酸菌工程菌的構(gòu)建成為了目前研究的熱點(diǎn)[9-13]。乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于乳酸菌安全、無內(nèi)毒素，表達(dá)的外源蛋白無需經(jīng)過純化可以直接連同菌體一起使用。外源蛋白質(zhì)在乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)中的分泌表達(dá)依賴于信號肽的引導(dǎo)[14]。已有研究表明，乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)中不同信號肽對同一種外源蛋白質(zhì)的引導(dǎo)分泌效率可能相差較大，即信號肽與外源蛋白質(zhì)之間存在適配性[15]。因此，針對特定的外源蛋白質(zhì)需要選擇合適的信號肽來實(shí)現(xiàn)其在乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)中的有效分泌表達(dá)。

來源于高溫烷烴地芽孢桿菌（Geobacillus thermoleovorans）的α-淀粉酶Gt-amy屬于嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶，可有效降解玉米淀粉，其最適反應(yīng)pH值為5.0，Gt-amy是目前文獻(xiàn)報(bào)道的玉米淀粉降解率最高的嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶[16]。為了提高嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy在飼料工業(yè)中的應(yīng)用可行性，該研究以實(shí)驗(yàn)室前期從健康仔豬腸道黏膜上分離純化得到的具有優(yōu)良益生特性的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）EXW27[17]為宿主菌，以大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒pSIP401為表達(dá)載體，對來源于糞腸球菌的8種信號肽進(jìn)行篩選，旨在獲得引導(dǎo)Gt-amy在糞腸球菌EXW27中高效分泌表達(dá)的信號肽，從而構(gòu)建組成型分泌表達(dá)生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的重組糞腸球菌，以期構(gòu)建既具有益生特性又具有生淀粉α-淀粉酶活性的轉(zhuǎn)基因糞腸球菌，為生淀粉α-淀粉酶Gt-amy在飼料工業(yè)的應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、糞腸球菌（Entercoccus faecalis）EXW27、重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamyhds[18]、大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒pSIP401[19]：實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

KOD-Plus-neo脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：日本Toyobo公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker：美國Fermentase公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒：美國Omega Bio-tek公司；Chelating SepharoseTMFast Flow：美國GE Healthcare公司；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物、紅霉素（均為分析純）：上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，瓊脂2%。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

MRS液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，牛肉膏1%，葡萄糖2%，磷酸氫二鉀0.2%，檸檬酸氫二銨0.2%，乙酸鈉0.4%，硫酸鎂0.058%，硫酸錳0.025%，吐溫0.1%，pH 6.2。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。MRS固體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

MastercyclergradientPCR儀：美國Eppendorf公司；TY04S-3C型凝膠成像系統(tǒng)：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；SCIENTZ-ⅡD型超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；SP-752PC型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒pSIP401Z-gtamyhds的構(gòu)建與鑒定

基于生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的基因gtamy的堿基序列，設(shè)計(jì)引物P1和P2（見表1）。以重組質(zhì)粒pSTOP1622-gtamyhds為模板，PCR擴(kuò)增基因gtamy中不含信號肽的結(jié)構(gòu)基因gtamyhds。PCR擴(kuò)增體系：10×buffer I 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）5 μL，MgSO45 μL，引物P1和P2各2 μL，模板1 μL，KOD-Plus-neo DNA聚合酶2 μL，雙蒸水（ddH2O）28 μL。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，74 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；74 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Xho I和Hind III雙酶切，連接至經(jīng)相同雙酶切處理的載體pSIP401，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSIP401-gtamyhds。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含200 μg/mL紅霉素的LB固體平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取LB固體平板上的轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒，采用Xho I和Hind III進(jìn)行雙酶切，鑒定陽性重組子。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所用引物序列Table 1 Primer sequences for the construction of recombinant plasmids

在重組質(zhì)粒pSIP401-gtamyhds的基礎(chǔ)上，參照文獻(xiàn)[20]中人工啟動子文庫構(gòu)建方法，根據(jù)質(zhì)粒pSIP401和基因gtamy的堿基序列設(shè)計(jì)引物P3和P4，將重組質(zhì)粒pSIP401-gtamyhds中啟動子替換為本實(shí)驗(yàn)室前期研究工作篩選得到的糞腸球菌中組成型高表達(dá)的啟動子p10[21]，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSIP401Zgtamyhds。組成型高表達(dá)啟動子p10的堿基序列為5'-AGATCTGCATAAAAAGTTCTTGACACTATATTAAGGCATTGTTAAGATATAGAAATAGCG-3'。具體步驟如下：以重組質(zhì)粒pSIP401-gtamyhds為模板，采用引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：10×buffer I 5 μL，dNTP 5 μL，MgSO45 μL，引物P3和P4各2 μL，模板1 μL，KOD-Plus-neo DNA聚合酶2 μL，ddH2O 28 μL。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，74 ℃延伸10 s，30個循環(huán)；74 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Bgl II和Nco I雙酶切，連接至經(jīng)相同雙酶切處理的載體pSIP401-gtamyhds，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSIP401Z-gtamyhds。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含200 μg/mL紅霉素的LB固體平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取LB固體平板上轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，并與對應(yīng)基因序列進(jìn)行BLAST比對確認(rèn)。

1.3.2 信號肽篩選質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)[22]提供的糞腸球菌來源的信號肽（s1～s8）的基因序號，在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中找出糞腸球菌中信號肽的氨基酸序列和對應(yīng)的基因序列，其中氨基酸序列的具體信息見表2。采用化學(xué)全合成方法[18]合成包含限制性酶切位點(diǎn)Nco I和Xho I以及信號肽堿基序列的DNA片段：5'-AGCCATGG（Nco I）-信號肽堿基序列-CTCGAG（Xho I）TG-3'。所合成的DNA片段經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切，連接至經(jīng)相同雙酶切處理的載體pSIP401Z-gtamyhds，構(gòu)建信號肽篩選質(zhì)粒pSIP401Z-（s1～s8）-gtamyhds。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含200 μg/mL紅霉素的LB固體平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取LB固體平板上轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，并與對應(yīng)基因序列進(jìn)行BLAST比對確認(rèn)。

表2 糞腸球菌來源的信號肽Table 2 Signal peptides from Entercoccus faecalis

1.3.3 重組糞腸球菌的構(gòu)建

參照文獻(xiàn)[19]將信號肽篩選質(zhì)粒pSIP401Z-（s1～s8）-gtamyhds電擊轉(zhuǎn)化至E.faecalisEXW27，并涂布于含10μg/mL紅霉素的MRS固體平板上，37℃培養(yǎng)24h，獲得重組E.faecalisEXW27/pSIP401Z-（s1～s8）-gtamyhds（S1～S8）。

1.3.4 重組糞腸球菌中嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的組成型分泌表達(dá)和純化

將重組糞腸球菌涂布于含10 μg/mL紅霉素的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。然后轉(zhuǎn)接于含10 μg/mL紅霉素的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，接種量為3%（V/V），37 ℃條件下靜置培養(yǎng)36 h。發(fā)酵液在4 ℃條件下經(jīng)8 000×g離心5 min，分別收集菌體沉淀和發(fā)酵上清液。采用50 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）（pH 5.0）緩沖液重懸菌體沉淀，置于冰上用超聲波破碎細(xì)胞。超聲波細(xì)胞破碎條件：超聲波功率250 W，超聲波破碎時間3 s，間歇6 s。超聲波處理菌體細(xì)胞至菌體懸液變?yōu)榫坏娜芤海?2 000×g離心5 min后收集上清，即為重組糞腸球菌胞內(nèi)成分。分別測定發(fā)酵上清液和重組糞腸球菌胞內(nèi)的α-淀粉酶酶活，并采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測發(fā)酵上清液和重組糞腸球菌胞內(nèi)重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶的表達(dá)情況。以轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒pSIP401的重組糞腸球菌為陰性對照（C1），以轉(zhuǎn)化了重組載體pSIP401Z-gtamyhds的重組糞腸球菌為陰性對照（C2），篩選最優(yōu)信號肽。

采用Ni2+親和層析柱對發(fā)酵上清液中的嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy進(jìn)行純化，用250 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，即得到純化后的嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy。利用SDS-PAGE檢測嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的純度，并采用Bradford法[23]測定其濃度。

1.3.5 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的酶學(xué)性質(zhì)分析

參照文獻(xiàn)[24]測定重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適反應(yīng)pH值、pH穩(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度、80 ℃熱穩(wěn)定性以及玉米淀粉降解率。

1.3.6 檢測方法

嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy分子質(zhì)量：參照文獻(xiàn)[25]，采用SDS-PAGE檢測。

嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy對可溶性淀粉的酶活力測定：將10μL酶液與490μL含1%可溶性淀粉的50 mmol/L MES（pH 5.0）緩沖液混合，80 ℃條件下反應(yīng)30 min，迅速冰浴，終止反應(yīng)，然后采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitros alicylic acid，DNS）法[26]測定反應(yīng)體系中還原糖量。酶活力單位定義：在一定反應(yīng)條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用軟件SigmaPlot 12.5對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 信號肽的篩選

重組E.faecalisEXW27/pSIP401Z-（s1～s8）-gtamyhds（S1～S8）發(fā)酵上清液和胞內(nèi)嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy活性測定結(jié)果見圖1。

圖1 不同信號肽對嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy活性的影響Fig.1 Effect of different signal peptides on thermoacidiphilic raw starch α-amylase Gt-amy activity

由圖1可知，陰性對照C1和C2發(fā)酵上清液中的Gt-amy活性較低，胞內(nèi)Gt-amy活性較高，8種信號肽均能引導(dǎo)Gt-amy分泌至發(fā)酵上清液中，其中重組菌S7發(fā)酵上清液中的Gt-amy活力最高，為310 U/mL。結(jié)果表明，信號肽s7有利于嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy分泌至胞外，可實(shí)現(xiàn)Gt-amy在糞腸球菌中的高效分泌表達(dá)。

重組E.faecalisEXW27/pSIP401Z-（s1～s8）-gtamyhds（S1～S8）發(fā)酵上清液和細(xì)胞裂解液的SDS-PAGE檢測結(jié)果見圖2。由圖2可知，轉(zhuǎn)化了不同信號肽篩選載體的重組糞腸球菌的發(fā)酵上清液中均有一條分子質(zhì)量約為56 kDa的蛋白質(zhì)條帶，而陰性對照C1和C2的發(fā)酵上清液中未見明顯的蛋白質(zhì)條帶。且使用信號肽s7后，重組糞腸球菌發(fā)酵上清液中嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的表達(dá)量明顯提高，這與α-淀粉酶活性測定結(jié)果一致。由圖2B可知，陰性對照C2的發(fā)酵菌體中能觀察到約56 kDa的蛋白質(zhì)條帶，而陰性對照C1以及其他重組糞腸球菌的發(fā)酵菌體中未能明顯觀察到大小相同的蛋白質(zhì)條帶。

圖2 重組糞腸球菌上清液（A）及細(xì)胞裂解液（B）的SDS-PAGE結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE results of fermentation supernatant(A)and cell lysis solution(B)of recombinant Entercoccus faecalis

以上研究結(jié)果表明，信號肽s7能夠引導(dǎo)嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy在糞腸球菌EXW27中分泌表達(dá)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，信號肽s7為脂蛋白（EF0071）的信號肽[22]。

2.2 重組糞腸球菌中嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的純化

重組糞腸球菌S7中嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy純化后的SDS-PAGE檢測結(jié)果見圖3。由圖3可知，重組糞腸球菌S7中嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的分子質(zhì)量約為56 kDa，與理論值基本一致。

圖3 純化后嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE results of thermoacidiphilic raw starch α-amylase Gt-amy after purification

2.3 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適作用pH值和pH穩(wěn)定性

pH值對重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy活力的影響見圖4。由圖4A可知，重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適反應(yīng)pH值為5.0，且其在pH值4.5～7.0范圍內(nèi)具有50%以上相對酶活。由圖4B可知，其在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)具有50%以上的相對酶活。重組糞腸球菌表達(dá)的重組Gt-amy的最適反應(yīng)pH值和pH穩(wěn)定性與野生型Gt-amy[16]基本一致。

圖4 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適作用pH值（A）及pH穩(wěn)定性（B）Fig.4 Optimal reaction pH(A)and pH stability(B)of recombination thermoacidiphilic raw starch α-amylase Gt-amy

2.3.2 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適作用溫度和熱穩(wěn)定性

溫度對重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy活力的影響見圖5。由圖5A可知，重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適反應(yīng)溫度為80 ℃。由圖5B可知，其于80 ℃的半衰期約為3 h。重組糞腸球菌表達(dá)的重組Gt-amy的最適反應(yīng)溫度和于80 ℃條件下的熱穩(wěn)定性與野生型Gt-amy[16]基本一致。

圖5 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的最適作用溫度（A）及80 ℃條件下熱穩(wěn)定性（B）Fig.5 Optimal reaction temperature(A)and thermal stability(B)at 80 ℃of recombination thermoacidiphilic raw starch α-amylase Gt-amy

2.3.3 嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy對玉米淀粉的降解

圖6 重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的玉米淀粉降解率Fig.6 Corn starch hydrolysis rate of recombinant thermoacidiphilic raw starch α-amylase Gt-amy

由圖6可知，在40 ℃條件下，重組嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy對30%玉米淀粉的降解率隨著時間的延長而提高。當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到3 h，重組嗜熱酸性生淀粉Gt-amy對玉米淀粉的降解率達(dá)到55.8%。結(jié)果表明，重組糞腸球菌所表達(dá)的重組嗜熱酸性生淀粉Gt-amy可降解玉米淀粉，這為重組嗜熱酸性生淀粉Gt-amy在飼料工業(yè)中的提供了理論依據(jù)。

3 結(jié)論

以誘導(dǎo)型大腸桿菌-乳酸菌穿梭載體pSIP401為表達(dá)載體，首先采用本實(shí)驗(yàn)室前期研究工作篩選得到的高效組成型啟動子P10替換pSIP401-gtamyhds中誘導(dǎo)型啟動子，然后分別引入糞腸球菌來源的8種信號肽，構(gòu)建嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy在糞腸球菌EXW27中組成型分泌表達(dá)的信號肽篩選載體。采用電擊轉(zhuǎn)化方法將信號肽篩選載體轉(zhuǎn)入具有優(yōu)良益生特性的糞腸球菌EXW27來構(gòu)建重組糞腸球菌。通過比較重組糞腸球菌的發(fā)酵上清液中α-淀粉酶活性，確定信號肽s7能夠最高效引導(dǎo)重組Gt-amy分泌至重組糞腸球菌胞外，發(fā)酵上清液中重組Gt-amy活性達(dá)到310 U/mL。重組Gt-amy的最適反應(yīng)pH值為5.0，在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，最適反應(yīng)溫度為80 ℃，于80 ℃的半衰期為3 h，在40 ℃條件下反應(yīng)3 h，對玉米淀粉的降解率達(dá)到55.8%。本研究構(gòu)建了既具有益生特性又具有嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶活性的轉(zhuǎn)基因糞腸球菌，這為嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy在飼料工業(yè)的應(yīng)用提供了新思路，也為研制新型轉(zhuǎn)基因微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。