百香果全果酒發酵工藝優化及體外抗氧化性比較分析

程宏楨，蔡志鵬，王 靜，沈勇根*，盧劍青，李曉明，劉馥源，徐 弦，安兆祥

（江西農業大學 食品科學與工程學院 江西省發展與改革委員會 農產品加工與安全控制工程實驗室，江西 南昌 330045）

百香果（Passiflora coeruleaL.），學名西番蓮，是西番蓮科多年生草本植物，在我國主要栽培于廣西、江西和云南等地[1]。紫皮百香果果汁中富含多酚、黃酮、類胡蘿卜素和維生素C（vitamin C，VC）等生物活性物質[2]，果皮中富含果膠、纖維素和花色苷等活性成分[3]，均具有極高的食用價值。研究表明，百香果具有抗炎[4]、抗氧化[5]、降糖[6]、抗焦慮[7]和抗衰老[8]等功效。將百香果全果釀造成果酒，既能保留百香果中的營養物質，又能將果皮副產物綜合利用，提升果酒的價值。市場上百香果酒主要使用百香果汁以酒精浸提法制得而非正規發酵[9]，這大大降低了百香果酒的香氣、口感和營養價值。經發酵產生的百香果全果酒為全天然食品，特征香氣突出，口感醇厚，酸甜適口，可以促進人體代謝與血液循環，改善心腦血管健康和抗衰老[10-11]。同時，百香果中具有抗氧化能力的多酚類、多糖類和花色苷類化合物在酒精發酵中逐漸浸出[12]，這些物質可以清除自由基，達到保健的功效[13]。

目前，在我國市售百香果果汁酒較常見，但未見百香果全果酒的蹤跡，且百香果皮利用率極低，造成副產品的極大浪費。此外，國內外關于百香果果汁、果汁酒和全果酒的抗氧化性能鮮見報道。本研究以紫皮百香果為原料發酵百香果全果酒，通過單因素試驗結合響應面法，確定百香果全果酒的最適釀造工藝，并通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS+）、羥基自由基（·OH）和還原能力這四個抗氧化體系來評價其與百香果果汁酒和原汁的抗氧化活性，以期為百香果的深加工、果皮的綜合利用提供新思路，為百香果全果酒的開發提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“紫香一號”百香果：采自廣西崇左某農戶果園，于-80 ℃冰箱超低溫保藏。全果酒、果汁酒、原果汁：本實驗室自制。

果膠酶（酶活4 000 U/g）、纖維素酶（酶活10 000 U/g）、焦亞硫酸鉀、小蘇打、白砂糖（均為食品級）：寧夏和氏璧生物技術有限公司；葡萄酒活性干酵母RV171：安琪酵母股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、抗壞血酸、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、雙氧水、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA124S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；JYL-C012料理機：九陽股份有限公司；pHS-3E實驗室pH計：上海佑科儀器儀表有限公司；SHP-250智能生化培養箱：上海鴻都電子科技有限公司；WFJ 2100可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；LXJ-ⅡB離心機：上海安壽科學儀器廠；KW500-B硅藻土過濾器：鄭州玉祥機械設備有限公司；10英寸三級精密膜過濾器：煙臺帝伯士自釀機有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 百香果全果酒發酵工藝流程

百香果→預處理→破碎打漿→調節pH→酶解→加硫→接種酵母→主發酵→陳釀→倒罐→澄清→精濾→脫氣→滅菌→灌裝→百香果全果酒

1.3.2 操作要點

原料預處理：選取無病害、新鮮成熟、表皮紫色且無機械損傷的百香果，解凍后用無菌水清洗干凈，瀝干水分。

破碎打漿：全果打漿不易操作，因此先取出百香果果肉，用200目濾布過濾去籽，注意避免果籽破碎，防止油脂進入果汁影響發酵，收集百香果原果汁，備用。將百香果皮切成1～2 cm2的小塊，用料理機打漿，備用。

調節pH：用小蘇打調節百香果汁pH值為3.5左右。

酶解：原汁中添加0.08%果膠酶和0.08%纖維素酶，果皮漿中添加0.15%果膠酶和0.15%纖維素酶，40 ℃水浴加熱4 h。

加硫：添加100 mg/L焦亞硫酸鉀，防止氧化變質和雜菌污染。

菌種活化：取適量酵母RV171，按料液比1∶9（g∶mL）加入無菌水，37 ℃水浴活化25 min，按不同酵母接種量接種。

主發酵：考慮成本因素，按料液比1∶1（g∶mL）填料，全果酒發酵液為原果汁加果皮漿，果汁酒發酵液為原果汁加無菌水，并添加適量白砂糖，料液裝至發酵罐的70%，密封發酵，控制發酵溫度和時間，使用單向閥排氣，基本無氣泡產生，判斷為主發酵結束。

陳釀：將酒液轉移至儲酒罐中，發酵液裝至容器的90%，使用單向閥排氣，放于2 ℃冷庫貯藏，靜置發酵2個月。

澄清：用過濾面積8.5 mm的硅藻土過濾器粗濾1次，以產生澄清的酒液。

精濾：酒液用0.22 μm的精密膜過濾器精濾，使酒液達到最佳的感官品質。

脫氣：將儲酒罐置于水浴鍋中，80 ℃脫氣10 min。

滅菌：采巴氏滅菌法，將儲酒罐置于水浴鍋中，65 ℃恒溫加熱30 min。

灌裝：確保在無菌條件下灌裝，計量準確，封口可靠，噴碼清晰。

1.3.3 分析檢測

酒精度的測定：參照GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》酒精計法；可溶性固形物含量：使用手持式阿貝折光儀測定。

1.3.4 百香果全果酒發酵工藝優化單因素試驗

選擇影響百香果全果酒發酵效果的四個因素：初始糖度（16%、18%、20%、22%、24%）、酵母接種量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）、發酵溫度（19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃）、發酵時間（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）進行單因素試驗，測定百香果全果酒的酒精度和可溶性固形物含量。每組試驗均重復三次，取平均值。

1.3.5 百香果全果酒發酵工藝優化響應面試驗設計

以單因素試驗結果為依據，運用DesignExpert10.0軟件，利用Box-Behnken試驗設計，以A（初始糖度）、B（酵母接種量）、C（發酵溫度）為3個因素，以百香果全果酒酒精度（Y）為響應值，共設計17組響應面優化試驗。Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.3.6 百香果果酒品質的感官評定標準

感官評定標準參照蔡文超等[14]方法。感官評定小組由10人組成，對百香果果酒的色澤、香氣、口感和形態進行評分，滿分100分，具體評分細則見表2。

表2 百香果果酒的感官評定標準Table 2 Sensory evaluation standards of passion fruit wine

1.3.7 百香果汁酒和全果酒抗氧化能力的測定

（1）DPPH自由基清除能力的測定

精確吸取不同體積（0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL）的百香果全果酒、果汁酒和原汁于試管中，用蒸餾水補至2.0 mL，再分別加入0.2 mmoL/L的DPPH溶液2 mL，振蕩混勻，避光放置30 min，之后在波長517 nm處測定吸光度值Ai；以蒸餾水替代樣品為空白對照，測得吸光度值為A0；以0.15%維生素C（vitamin C，VC）溶液為陽性對照。DPPH自由基清除率計算公式如下：

（2）ABTS+自由基清除能力的測定

精確吸取不同體積（0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL）的百香果全果酒、果汁酒和原汁于試管中，用蒸餾水補至2.0 mL，分別加入ABTS+工作液2 mL，振蕩混勻，避光放置30 min，之后在波長734 nm處測定吸光度值Ai；以蒸餾水替代樣品為空白對照，測得吸光度值為A0；以0.15%VC溶液為陽性對照。ABTS+自由基清除率計算公式如下：

（3）·OH清除能力的測定

精確吸取不同體積（0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0mL）的百香果全果酒、果汁酒和原汁于試管中，用蒸餾水補至2.0 mL，依次加入6 mmoL/L的FeSO4溶液2 mL和6 mmoL/L的H2O2溶液2 mL，振蕩混勻，避光放置10 min，之后加入6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，振蕩搖勻，避光反應30 min，在波長510 nm處測定吸光度值Ai；以蒸餾水替代樣品為空白對照，測得吸光度值為A0；以蒸餾水替代水楊酸，測得吸光度為Aj；以0.15%VC溶液為陽性對照?！H清除率計算公式如下：

（4）還原能力的測定

精確吸取不同體積（0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL）的百香果全果酒、果汁酒和原汁于試管中，用蒸餾水補至2.0 mL，分別加入0.2 moL/L pH=6.6的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）2.5 mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，振蕩混勻，50 ℃水浴20 min，之后迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2 mL，然后在4 000 r/min條件下離心10 min，取2 mL上清液，加入0.1%的三氯化鐵溶液0.5 mL，再加入3.5 mL蒸餾水，振蕩混勻，之后在波長700 nm處測定吸光度值A；以0.15%VC溶液作為陽性對照。以吸光度值反映樣品還原能力，吸光度值越大，其還原能力越大，抗氧化活性越強。

1.3.8 數據分析

使用Excel 2016整合試驗數據，采用Origin 8.5制圖，Design Expert 10進行響應面優化設計，使用SPSS 20.0顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 百香果全果酒發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 不同初始糖度對百香果全果酒發酵效果的影響

由圖1可知，酒精度和可溶性固形物含量隨著初始糖度在16%～20%范圍內的增加而增大；初始糖度為20%～24%時，酒精度升高趨勢變緩，可溶性固形物含量繼續增大，說明初始糖度＞20%之后，發酵醪糖度過大，一方面酵母發酵所需底物過剩，造成糖的浪費；另一方面滲透壓升高，抑制了酵母的活性，發酵速率變慢，甚至引發副反應[15]，口感也會隨之下降。因此，考慮到經濟成本等原因，確定最適初始糖度為20%。

圖1 不同初始糖度對百香果全果酒發酵的影響Fig.1 Effect of different initial sugar contents on the fermentation of whole passion fruit wine

2.1.2 不同酵母接種量對百香果全果酒發酵效果的影響

由圖2可知，酒精度隨酵母接種量在0.01%～0.04%范圍的增大而上升，而可溶性固形物含量呈下降的趨勢。發酵醪中酵母接種量的多少決定著酵母菌生長速率、發酵速率和呼吸產能等變量的大小[16]。酵母接種量＜0.04%之前，發酵醪中酵母菌數量較少，發酵不完全，酒精度不高，接種量為0.04%時酵母菌數量增加，發酵速率加快，底物消耗增多，酒精度達到相對較高值，發酵較為充分。但隨著酵母接種量的繼續增大，酒精度只略有增大，可能是因為酵母菌濃度增加，底物消耗加快，使酵母間的競爭愈加劇烈，代謝加快，使代謝產物不斷累積，導致溫度升高[17]，這些對自身生長都起抑制作用。因此，確定最適酵母接種量為0.04%。

圖2 不同酵母接種量對百香果全果酒發酵的影響Fig.2 Effect of different yeast inoculum on the fermentation of whole passion fruit wine

2.1.3 不同發酵溫度對百香果全果酒發酵效果的影響

由圖3可知，隨著發酵溫度在19～31 ℃范圍內的增加，酒精度和可溶性固形物含量分別呈上升和下降的趨勢。發酵溫度在發酵過程中尤為重要，它極大地影響著酵母的生長代謝和發酵速率[18]。溫度過高，酵母菌繁殖迅速，發酵周期短，但代謝過于旺盛，代謝產物積累過多，造成提前老化，影響果酒風味的形成；溫度過低，酵母生長緩慢，發酵周期長[19]。當發酵溫度升至28 ℃時，酒精度升高趨勢變緩，此時酵母代謝較為旺盛，產酒能力達到較高值，若繼續升高溫度，酒精度升高緩慢，且會對發酵產生不利影響。因此，確定最適發酵溫度為28 ℃。

圖3 不同發酵溫度對百香果全果酒發酵的影響Fig.3 Effect of different fermentation temperature on the fermentation of whole passion fruit wine

2.1.4 不同發酵時間對百香果全果酒發酵效果的影響

由圖4可知，酒精度隨發酵時間在3～5 d范圍內的增大而上升，而可溶性固形物含量呈下降的趨勢，發酵時間＞5 d后趨勢均變緩。發酵開始后5 d是發酵初期，百香果全果酒酒精度增幅明顯，說明在這期間，酵母菌繁殖旺盛，數量和體積不斷增加，發酵速率較快，百香果全果酒酒精度不斷增加，在發酵時間5 d時酒精度達到相對較大值，且隨著發酵時間的繼續延長，酒精度增加不大，可能是酵母菌老化程度加大，活性降低，產酒能力下降[20]。因此，確定最適發酵時間為5 d。

圖4 不同發酵時間對百香果全果酒發酵的影響Fig.4 Effect of different fermentation time on the fermentation of whole passion fruit wine

2.2 百香果全果酒發酵工藝優化響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗的結果

根據單因素試驗結果，選取了對百香果全果酒發酵影響較大的3個因素，即初始糖度（A）、酵母接種量（B）、發酵溫度（C），以酒精度（Y）為響應值，17組響應面優化試驗及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

續表

2.2.2 響應面回歸模型的建立與分析

運用Design-Expert 10.0軟件，以初始糖度（A）、酵母接種量（B）、發酵溫度（C）為影響因素，百香果全果酒酒精度（Y）為響應值，得到17組試驗條件與響應值之間的回歸方程：

Y=13.54+0.85A+0.51B+1.49C-0.37A2-1.52B2-0.65C2-0.45AB+0.035AC+0.38BC

運用Design-Expert 10.0軟件對表2數據進行方差分析，結果見表3。由表3可知，模型中F值=247.87，P＜0.000 1，說明模型極顯著（P＜0.01）；失擬項P值=0.3680＞0.05，說明失擬項不顯著，回歸模型可以接受；決定系數R2=0.996 0，調整決定系數R2adj=0.992 0，說明實際酒精度與模型預測酒精度擬合程度高。因此，該模型能夠很好地表述各個因素與響應值之間的關系，對百香果全果酒酒精度進行分析和預測具有可行性。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根據表3顯著性檢驗可知，一次項A、B、C、二次項A2、B2、C2、交互項AB、BC對結果影響極顯著（P＜0.01），其他因素對結果影響不顯著（P＞0.05）。根據F值和P值，各因素對酒精度影響的主次順序為發酵溫度（C）＞初始糖度（A）＞酵母接種量（B）。

2.2.3 響應曲面各因素交互作用分析

響應曲面圖是對二元線性回歸方程形象化的描繪[21]，依據A、B、C三因素中兩因素交互作用與響應值之間的關系，得到的三維響應曲面和等高線，結果見圖5。

圖5 各因素交互作用對百香果全果酒酒精度影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on alcohol contents of whole passion fruit wine

響應面坡度越陡，說明兩因素間交互作用越顯著[22]。由圖5可知，AB、BC間曲面較為陡峭，說明初始糖度與酵母接種量、酵母接種量與發酵溫度之間的交互作用顯著（P＜0.01），對酒精度影響較大；AC響應曲面拱形程度不高，說明初始糖度與發酵溫度間交互作用不顯著（P＞0.05），與方差分析中結果一致。

2.3 驗證試驗

利用Desig-Expert 10.0軟件得到百香果全果酒最適發酵工藝條件為初始糖度20.6%、酵母接種量0.043%、發酵溫度28.7 ℃、發酵時間5 d，酒精度模型預測值為11.4%vol。為了方便實際操作，將發酵工藝條件修正為初始糖度21%、酵母接種量0.04%、發酵溫度29 ℃、發酵時間5 d。在此優化條件下進行3次平行驗證試驗，酒精度實際值為11.9%vol，與預測值基本一致，說明響應面分析得到的百香果全果酒釀造工藝參數可靠。

2.4 百香果汁酒和全果酒感官評分結果

百香果果汁酒呈淡黃色，酒液澄清透亮，果香明顯，酒香濃郁，入口醇厚但口感稍酸，無懸浮沉淀，感官評分為82.3分。百香果全果酒呈橙紅色，酒液澄清透亮，果香明顯，略帶木香味，酒香濃郁，酒體醇厚但口感稍酸，無懸浮沉淀，感官評分為85.6分。因此，全果酒比果汁酒感官評分高，這是因為全果酒中溶入了果皮中的花色苷等物質，使酒體色澤比果汁酒飽和度更高，且香氣更豐富。

2.5 百香果汁酒和全果酒抗氧化能力的比較分析

2.5.1 DPPH自由基清除能力的比較

由圖6可知，全果酒、果汁酒、原果汁三種樣品及VC的DPPH自由基清除率隨樣品用量的增加而增大。樣品用量在0.4～1.2 mL之間時，三種樣品的DPPH自由基清除率持續上升，在樣品用量到達1.2 mL時，此時三種樣品均已達到較高的自由基清除效果，全果酒、果汁酒和原果汁的清除率分別為97.16%、96.63%和95.90%，繼續增大樣品體積，三種溶液對DPPH自由基的清除率略有上升且增長緩慢。三種樣品對DPPH自由基的清除能力均小于VC溶液，相互之間差異顯著（P＜0.05）。由此可知，三種樣品對DPPH自由基清除效果大小順序為全果酒＞果汁酒＞原汁。

圖6 DPPH·清除能力的比較Fig.6 Comparison of scavenging ability of DPPH·

2.5.2 ABTS+自由基清除能力的比較

由圖7可知，三種樣品及VC的ABTS+自由基清除率隨樣品用量的增加而增大。在用量為0.2 mL時，全果酒、果汁酒和VC溶液已達到較高的自由基清除效果，對應的自由基清除率分別為98.47%、94.84%和98.14%，而原汁為90.40%，四者間差異極顯著（P＜0.05）。原汁在體積為0.4時增速變緩，清除率為98.55%。由此可知，全果酒的ABTS+自由基清除能力最強。

圖7 ABTS+·清除能力的比較Fig.7 Comparison of scavenging ability of ABTS+·

2.5.3 ·OH自由基清除能力的比較

由圖8可知，三種樣品及VC的·OH清除率隨樣品用量的增加而增大。其中全果酒和果汁酒在用量為0.4 mL時已達到較高的自由基清除效果，清除率分別為98.90%和98.05%，此時VC和原汁的清除率為73.47%和80.51%；在用量為0.4～1.2 mL時，VC的清除能力快速上升，在1.2 mL時清除能力達到較高值99.39%；原汁的清除率在試驗范圍內呈持續上升的趨勢，未稀釋的原汁清除率為93.82%，與其他三種溶液之間存在顯著差異（P＜0.05）。由此可知，·OH清除效果大小順序為全果酒＞果汁酒＞原汁。

圖8 ·OH清除能力的比較Fig.8 Comparison of scavenging ability of·OH

2.5.4 還原能力的比較

由圖9可知，三種樣品及VC的還原能力隨樣品用量的增加呈現良好的上升趨勢。在試驗范圍內，三種樣品的還原能力均小于VC溶液，且在樣品用量為2.0 mL時，全果酒、果汁酒和原汁的還原能力分別為VC溶液的98.15%、91.20%和61.11%，相互之間差異顯著（P＜0.05）。由此可知，三種樣品的還原能力大小順序為全果酒＞果汁酒＞原汁。

3 結論

本試驗運用響應面法確定了百香果全果酒的最適釀造工藝，結果表明，百香果全果酒最適發酵工藝條件為初始糖度21%、酵母接種量0.04%、發酵溫度29 ℃、發酵時間5 d。在此優化發酵工藝條件下，酒精度為11.9%vol。通過四個抗氧化體系（DPPH·、ABTS+·、·OH、還原能力）對比了百香果全果酒、果汁酒和原汁的體外抗氧化活性，結果表明，自由基清除率和還原能力均隨樣品用量的增加而增大，抗氧化特性的大小順序為全果酒＞果汁酒＞原汁。總體而言，百香果全果酒是一種具有高抗氧化活性的功能型果酒，以期為推廣百香果深加工和果皮綜合利用提供了新思路，且對百香果釀造酒的開發具有指導意義。