高酸度水果果酒釀造產酯酵母的鑒定及發酵特性研究

李 棒，鄧夢菲，陳延儒，萬 茵，劉成梅，付桂明

（1.南昌大學 食品學院 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學 國際食品創新研究院，江西 南昌 330047）

酵母是果酒釀造過程中決定果酒品質、口感和風味的關鍵因素[1-2]。傳統葡萄酒釀造過程中，除了釀酒酵母產酒精以外，常常伴有一些產酯（產香）酵母在發酵過程中起到增強特征果香味的作用[3]。有報道從各類水果果皮中篩得各種產酯酵母，包括戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）[4]、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）[5]、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）等[6-7]。同樣，在白酒釀造過程中，酒醅中微生物的代謝作用會產生豐富的微生物代謝產物，這些物質直接或間接地形成了白酒突出而獨特的香氣風味特征。其中產酯酵母對于提高酒中主體香氣（如乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯等）含量以及乙酸甲酯、辛酸乙酯等其他香氣物質具有重要作用[8]，大部分香味物質都具有明顯的果香特性，將其應用于果酒釀造過程中能夠較好地改善果酒的香氣特性。徐麗萍等[8-9]分別從瀘州大曲和安徽古井大曲中篩選得到數株產酯酵母，并發現它們具有良好的發酵特性。

本研究通過對本實驗室前期從藍莓果皮和特香型白酒酒醅中篩選得到的6株產酯酵母進行分子生物學鑒定和發酵特性（生長情況、產酒精、產總酯、耐受能力）研究，比較它們的發酵性能及對不同生長環境的抗逆性和耐受性。旨在篩選出適合用于果酒發酵的產酯酵母，用于高酸度水果果酒的生產，以提高果酒品質和改善酒的風味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

分別從藍莓果皮（江西思科有限公司種植園）及特香型白酒酒醅（江西省樟樹市樟樹貢酒業有限公司）中先后篩得40株酵母，通過形態觀察、生理生化試驗初步鑒定出6株產酯酵母，分別命名為E1～E6（菌株E1～E5來自特香型白酒酒醅，菌株E6來自藍莓果皮）。

1.1.2 化學試劑

酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物科技技術有限責任公司；瓊脂（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；蘋果酸、果糖（均為分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；酵母脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取抽提試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，用蒸餾水溶解定容到1 000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeastextractpeptone dextrose agar，YPDA）培養基：YPD培養基中加入20 g/L的瓊脂。

麥芽汁培養基：130 g/L麥芽浸粉，0.1 g/L氯霉素，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

模擬葡萄汁合成培養基：100 g/L葡萄糖，100 g/L果糖，1.5 g/L酵母提取物，0.3 g/L檸檬酸，5 g/L酒石酸，5 g/L蘋果酸，2 g/L硫酸銨，5 g/L磷酸二氫鉀，0.5 g/L硫酸鎂，0.2 g/L氯化鈉和0.05 g/L硫酸錳。用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液將培養基的pH值調節至3.2。

1.2 儀器與設備

SP-756P紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；PH50-3A43L-A光學顯微鏡：鳳凰光學股份有限公司；2720 Thermal Cycler 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ZHWY-2102C型恒溫培養振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；FE28型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；ZDX-35BI型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；JA5003分析電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化及種子液的制備

菌株E1～E6在YPDA固體培養基上活化后，挑取酵母菌株接種于YPD液體培養基中，于28 ℃、180 r/min條件下搖床培養24 h至對數生長期，通過光學顯微鏡血球計數法計算菌體濃度，再將菌液用無菌水稀釋至菌濃度為1×107CFU/mL，制成種子液。

1.3.2 菌種的鑒定及系統發育樹的構建

將菌種活化后，液體培養至對數生長期，用酵母DNA提取抽提試劑盒進行菌株總DNA提取。利用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）/ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對酵母5.8S rDNA ITS區序列進行PCR擴增，擴增條件參照文獻[10]。PCR產物送至上海生工生物技術有限公司測序。所獲5.8S rDNA ITS區序列在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）GenBank 數據庫中利用Blast程序進行核酸序列比對，采用MEGA5.0軟件中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構建系統發育樹，并進行親緣關系分析。

1.3.3 酵母菌株生長曲線的測定

將酵母種子液以1×105CFU/mL的接種量接種于YPD液體培養基中，于28 ℃、180 r/min條件下搖床培養，每隔4 h取1 mL菌液，血球計數法計算菌體濃度，繪制生長曲線。

1.3.4 酵母菌株發酵力的測定

采用CO2失重法[11]，將活化好的菌種按1×105CFU/mL接種量接入麥芽汁液體培養基，于26 ℃條件下靜置培養。每12 h測定1次質量，培養7 d。以CO2失質量為縱坐標，發酵時間為橫坐標，繪制菌株發酵力曲線。

1.3.5 酵母產總酯能力測定

參照GB/T10345—2007《白酒分析方法》[12]，將酵母種子液以1×105CFU/mL的接種量接種于麥芽汁培養基中，單向出氣發酵栓密封，26 ℃靜置發酵7 d，采用皂化中和滴定法，測定總酯產量。

1.3.6 酵母菌的耐受性測定

參照吳啟鳳等[13]方法略有改進后進行酒精、SO2、pH和高糖耐受性測定。

（1）酵母耐酒精能力測定

將對數生長期酵母種子活化液，以5×105CFU/mL接種量接入不同酒精度（3%vol、6%vol、9%vol、12%vol、15%vol、18%vol、21%vol）的模擬葡萄汁合成培養基中，在26 ℃下靜置發酵培養3 d（每隔12 h振蕩懸浮一次），采用光學顯微鏡血球計數法測定各菌液的酵母細胞生長數。

（2）酵母耐SO2能力測定

將對數生長期酵母種子活化液，以5×105CFU/mL接種量接入不同SO2質量濃度（0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L）的葡萄汁合成培養基中，在26 ℃下靜置發酵培養3 d（每隔12 h振蕩懸浮一次），采用光學顯微鏡血球計數法測定各菌液的酵母細胞生長數。

（3）酵母耐pH能力測定

將對數生長期酵母種子活化液，以5×105CFU/mL接種量接入不同pH值（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）的模擬葡萄汁合成培養基中，在26 ℃下靜置發酵培養3 d（每隔12 h振蕩懸浮一次），采用光學顯微鏡血球計數法測定各菌液的酵母細胞生長數。

（4）酵母耐糖能力測定

將對數生長期酵母種子活化液，以5×105CFU/mL接種量接入不同糖含量（30%、40%、50%、60%、70%、80%）的葡萄汁合成培養基中，在26 ℃下靜置發酵培養3 d（每隔12 h振蕩懸浮一次），采用光學顯微鏡血球計數法測定各菌液的酵母細胞生長數。

1.3.7 數據處理

采用Excel 2013、Origin 9.0軟件進行數據處理分析，SPSS 25.0進行數據單因素方差分析，MEGA5.0進行系統發育樹構建。每組實驗重復測定3次。

2 結果分析

2.1 菌株的分子生物學鑒定

6株酵母的5.8S rDNA ITS區序列的NCBI比對結果見表1，將其構建系統進化樹所得6株酵母菌株之間的親緣關系見圖1。由表1可知，在ITS區，菌株E1與異常畢赤酵母（Pichia anomala）相似性為99.32%，菌株E2與庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）相似性為100%，菌株E3與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）相似性為99.83%，菌株E4與光滑假絲酵母（Candida glabrata）相似性為99.65%，菌株E5與戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）相似性為99.22%，菌株E6與德巴利漢遜酵母（Debaryomyces hanseni）相似性為100%。可鑒定菌株E1為異常畢赤酵母（P.anomala）、菌株E2為庫德里阿茲威畢赤酵母（P.kudriavzevii）、菌株E3為異常威克漢姆酵母（W.anomalus）、菌株E4為光滑假絲酵母（Candida glabrata）、菌株E5為戴爾凱氏有孢圓酵母（T.delbrueckii）、菌株E6為德巴利漢遜酵母（D.hanseni）。由圖1可知，菌株E1（P.anomala）和E3（W.anomalus）位于同一小分枝，說明之間有很近的親緣關系，在系統發育樹上形成同一類群，而其余菌株各自親緣關系差異明顯，各自形成獨立小分枝。在大分枝上菌株E1（P.anomala）、E2（P.kudriavzevii）、E3（W.anomalus）、E6（D.hanseni）親緣性靠近，屬于同一大分枝；菌株E4（Candida glabrata）、E5（T.delbrueckii）親緣性靠近，屬于同一大分枝。

表1 被測序菌株來源與相關菌株序列相似性Table 1 Sequence similarity between sequenced strains and related strains

圖1 基于5.8S rDNA ITS區基因序列的產酯酵母菌系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of ester-producing yeast strains based on 5.8S rDNA ITS region gene sequence

2.2 酵母菌的生長曲線

對6株產酯酵母進行生長性能的測定并繪制生長曲線，結果見圖2。

圖2 6株產酯酵母菌生長曲線Fig.2 Growth curves of 6 strains of ester-producing yeast

由圖2可知，6株酵母均在0～8 h處于延滯期，8 h后進入對數生長期，而菌株E1（P.anomala）和E3（W.anomalus）在20 h后進入平穩期，其余菌株均在32 h后進入平穩期，其中菌株E1（P.anomala）和E3（W.anomalus）在44 h后開始進入衰亡期。于洋等[14]認為非釀酒酵母一般在發酵前期生長旺盛，能夠產生較高含量的香氣物質，但隨著酒精體積分數的不斷升高其優勢逐漸被釀酒酵母所替代。6株產酯酵母中，菌株E1（P.anomala）生長速度最快，4 h結束延滯期進入對數生長期，且能達到最高的菌體濃度，為10.5×108個細胞/mL，菌株E6（D.hanseni）生長速度最慢，32 h才結束延滯期進入對數生長期，48 h時菌體濃度為9.2×108個細胞/mL。但生長48 h菌體濃度最低的是E4（C.glabrata），僅為3.2×108個細胞/mL。劉燦珍等[15]研究發現，陸生伊薩酵母（Lssatchenkia terricola）、淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）、葡萄汁有孢漢遜酵母（H.uvarum）、美極梅奇酵母（M.pulcherrima）和戴爾有孢圓酵母（T.delbruecki）5株產酯酵母在0～5 h為延滯期，5～22 h為對數生長期，22 h后進入平穩期；原苗苗等[16]研究發現，H.uvarum、M.pulcherrima和T.delbruecki這三株產酯酵母在0～4 h為延滯期，4～14 h為對數生長期，14 h后進入平穩期。產酯酵母的生長速度存在一定差異，可能由于菌種個體差異及培養過程中基質條件動態變化引起的，菌株E1（P.anomala）生長速度最快，有利于釀造過程快速起酵。

2.3 酵母菌的發酵力

發酵力反映酵母發酵糖產生酒精能力的大小，可以衡量產酯酵母在厭氧條件下生存能力。發酵力越強，表明酵母在厭氧情況下生長優勢明顯，在混合發酵前期能累積更多的香氣物質。6株酵母菌發酵力測定結果見圖3。由圖3可知，6株酵母菌種普遍在發酵后0.5～1.5 d之間生長最為旺盛。菌株E1（P.anomala）、菌株E3（W.anomalus）、菌株E4（T.delbrueckii）和菌株E5（C.glabrata）這4株菌株具有較強的發酵力，其中菌株E1（P.anomala）的發酵力最強，7 d最高總失質量為1.30 g，在發酵初期（1 d）時失量高達1.18 g/d，而菌株E2（P.kudriavzevii）和E6（D.hanseni）發酵力較弱，7 d總失質量分別為0.61 g和0.32 g，低于牛廣財等[17]所報道的釀酒酵母發酵力最高值（2.73 g/d）。結果表明，菌株E1具有最好的生長和發酵性能。

圖3 6株產酯酵母菌發酵力測定結果Fig.3 Determination results of fermentation abilities of 6 strains of ester-producing yeasts

2.4 產酯酵母產總酯能力

酯類物質是果酒香氣物質的主要組成成分之一，總酯的高低可以在一定程度上反映酵母產生香氣物質的情況。對6株產酯酵母所產生的總酯進行測定，結果見表2。由表2可知，菌株E1（P.anomala）和E4（C.glabrata）總酯產量分別為3.71 g/L和3.53 g/L，菌株E3（W.anomalus）產總酯能力最強，達3.91 g/L，菌株E6（D.hanseni）產酯能力最弱，僅為3.39 g/L。與許多研究報導的W.anomalus是產總酯能力強的酵母一致。史雁飛等[18]報道一株固定化后的W.anomalus所產總酯含量高達3.4 g/L。FAN G S等[19]報道W.anomalus能夠有效地改善發酵過程中的香味物質，通過W.anomalus和Saccharomyces cerevisiae兩種酵母的協同發酵不僅提高了乙酸乙酯的產量，還增加了β-苯乙醇和苯乙基的含量，從而改善了白酒的風味。菌株E3（W.anomalus）最高的產總酯能力可以為改善風味提供更大地潛能。

表2 6株產酯酵母菌株產總酯結果Table 2 Results of total ester production capacity of 6 strains of ester-producing yeasts

2.5 產酯酵母耐受性比較

2.5.1 酒精耐受性比較

由圖4可知，在酒精耐受性方面，6株產酯酵母普遍在6%vol酒精度下能夠具有良好的生長狀態，當酒精度＞9%vol之后生長受到較大抑制，菌體生長細胞數顯著下降。其中菌株E1（P.anomala）對酒精耐受性最強，在9%vol酒精度下生長狀態最好；菌株E6（D.hanseni）對酒精最敏感，在6%vol酒精度下生長就基本被完全抑制。劉燦珍等[15]報道中產酯酵母的生長隨著酒精度的增長呈下降趨勢，且在酒精度到達6%vol時生長量驟然下降，于洋等[14]也報道3株非釀酒酵母，東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）和季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondi）在酒精度到達6%vol之后抑制效果顯著。張莉等[20]認為，耐酒精能力強的酵母菌株可以發酵更加完全、徹底。菌株E1（P.anomala）良好的酒精耐受性能，使其在果酒發酵中可維持良好的生存狀態，累積更多的香味物質，滿足果酒釀造的需要[21]。

圖4 6株產酯酵母菌酒精耐受能力比較Fig.4 Comparison of alcohol tolerance of 6 strains of ester-producing yeasts

2.5.2 SO2耐受性比較

在果酒釀造過程中，適量SO2可以抑制某些微生物（包括乳酸菌和醋酸菌）的生長，防止果酒的二次發酵和果酒的腐敗。但是SO2添加量太多會影響酵母的活性，使其發酵遲緩，酒體變苦[10]。因此，良好的SO2耐受性可以保證產酯酵母在發酵前期不受SO2添加量的影響。由圖5可知，6株酵母均在SO2＜200 mg/L的質量濃度下能夠良好的生長；當SO2質量濃度＞200 mg/L之后，6株酵母的生長逐漸受到抑制，隨著SO2質量濃度升高，抑制效果越顯著，其中菌株E5（T.delbrueckii）對SO2耐受性最強，300 mg/L SO2質量濃度下仍能良好的生長，菌株E3（W.anomalus）對SO2耐受性最弱，與張莉等[20，22]報道篩選釀酒酵母菌株研究結果相符。

圖5 6株產酯酵母SO2耐受能力比較Fig.5 Comparison of SO2 tolerance of 6 strains of ester-producing yeasts

2.5.3 pH耐受性比較

酵母酸度耐受性差可能導致發酵初期起酵速度緩慢，嚴重時甚至會提前終止果酒發酵[1]。因此篩選出對低pH高耐受性的菌株對于果酒至關重要。藍莓果實中果汁的pH約為3.2，青梅、李子等水果pH約為3.0。對低pH的耐受性是優良藍莓釀造酵母的重要值特性。由圖6可知，6株產酯酵母在pH 3.5～5.0能夠呈現良好的生長狀態，而產酯酵母E1（P.anomala）和E4（C.glabrata）pH耐受性最強，在pH 3.0的培養基中能良好的生長，分別達到菌體濃度5.47×107個細胞/mL和6.17×107個細胞/mL。另外，菌株E6（D.hanseni）pH耐受性最差，只能在pH 4以上才能正常生長。石陽明等[23]從沙果和桃子中篩得8株產酯酵母在pH 2.5的條件下開始緩慢生長，在pH 3.5之后生長狀態良好，與本研究基本相符。

圖6 6株產酯酵母pH耐受性比較Fig.6 Comparison of pH tolerance of 6 strains of ester-producing yeasts

2.5.4 高糖耐受性比較

在一些甜型果酒釀造過程中，需要額外添加一定量的蔗糖保證發酵后的酒精度和甜度，但發酵醪糖度過高，會使酵母細胞處于高滲透壓環境，生長受抑制。對糖度耐受性強的菌株可以更好地適應環境，快速地生長[14]。6株產酯酵母糖耐受性結果見圖7。

圖7 6株產酯酵母高糖耐受性比較Fig.7 Comparison of high sucrose tolerance of 6 strains of ester-producing yeast

由圖7可知，在糖度＜70%時受高糖抑制效應影響較小，糖度＞70%則隨著蔗糖濃度升高抑制效果顯著增強，但菌株E2（P.kudriavzevii）在高蔗糖環境下生長最好，菌株E6（D.hanseni）在高蔗糖環境下生長最差。

3 結論

對前期從藍莓果皮及特香型白酒酒醅中篩得的6株產酯酵母進行分子生物學鑒定，確定它們的種屬和物種親緣性。同時通過生長曲線和發酵力的測定，比較了這6株產酯酵母好氧及厭氧情況下的生長狀況及產氣能力。

結果表明，菌株E1（P.anomala）具有最快的生長速度和最強的發酵力。通過產總酯能力比較發現，菌株E3（W.anomalus）產總酯能力最高達3.91 g/L，其次是菌株E1（P.anomala）總酯產量為3.71 g/L。菌株E1（P.anomala）對酒精耐受性最強，在9%vol酒精濃度下可以呈現良好生長狀態；且在SO2＜200 mg/L的質量度下，pH 3.0的培養基環境中，蔗糖含量＜70%時能夠良好的生長。所以菌株E1（P.anomala）是具有突出的起酵、產總酯能力和較好的耐受性能菌株，可作為藍莓等高酸度水果果酒釀造的優良產酯酵母菌株。