石斛花金柚幼果功能性果酒釀造工藝研究

黎敏儀，黃嫣怡，陳子煬，李一川，賴升敬，霍志雄，陳李頡，王 琴，劉袆帆

（仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州 510000）

柚子中含有類胰島素、柚皮苷、新橙皮苷、揮發油、維生素B1、維生素B2、煙酸、果糖、葡萄糖、蛋白質、酯類、鐵、鈣、磷及粗纖維等活性成分[1-3]，具有健脾、止咳、助消化、抗高血壓、抗氧化、抗糖尿病、抗血管硬化等保健功能[4]。如今，市面上普遍存在的柚子產品有柚子茶、柚子果凍、金柚涼果、柚子復合酒等，大多以營養保健為主[5]，以柚子幼果為原料制成的產品較為鮮見。目前，我國柚子以鮮食為主。據統計，我國最大的柚子產區—廣東省梅州市的總種植面積為2萬hm2，總產量達32.5萬t[5-6]。金柚種植過程中有大量自然掉落的金柚幼果[7]。自然掉落的幼果為青色，皮厚肉少，銷售價值大幅下降，造成大量的經濟損失與浪費。據研究，柚皮質量占整個柚子的43%～48%（幼果柚皮所占比例更高）[8]，提高柚皮利用率在金柚幼果高值化利用上具有實際意義。在我國水果產能過剩的情況下，水果釀酒是解決該問題的重要方法；同時釀制的果酒都具有高的營養價值和對人體健康有益的特點[5-6]。

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬多年附生草本植物，在福建、廣東、廣西、云南、貴州等地均有分布[12]，是一味常用的藥食兩用中藥材。有研究表明，其含有豐富的多糖、黃酮類、氨基酸類、生物堿類等活性成分[13-16]，具有養陰生津、抗腫瘤抗突變、降血壓、增強機體免疫力及抗氧化等活性功能[17]。有研究表明，石斛花具有既可藥用，也可用作香料的成分[15]；許多茶商也將其開發成保健品花茶飲料[18-19]。

每年金柚殘次果浪費較多，并且效益不高[11]。為了改善金柚幼果造成的資源浪費和環境污染等問題，本試驗在前人制作柚子果酒的基礎上[20-22]，利用金柚幼果進行果酒發酵，配合加入鐵皮石斛，使果酒兼備其兩者活性功能成分，通過探究在金柚幼果的處理方法和發酵過程中的影響果酒發酵質量的因素[23]，優化石斛花金柚幼果功能性果酒的發酵工藝，使果酒更具營養價值和較佳風味，從而提高金柚幼果的利用率和其自身價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛鮮花：市售；金柚幼果：來自廣東梅州沙田柚基地；SY酵母：湖北安琪酵母有限公司；果膠酶（酶活力3 000 U/g）、檸檬酸、β-環糊精：瑞永公司；白砂糖：上海楓未實業有限公司；纖維素酶（酶活700 EGU/g）：諾維信公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：鄭州博研生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C精密酸度計：上海雷磁儀器有限公司；UV-1100B分光光度計：美譜達儀器有限公司；DHP-9032生化恒溫培養箱：上海一恒儀器有限公司；WYT手持糖度計：成都豪創光電儀器有限公司；MJ-PB40E25SE攪拌機：美的集團；SHJ-4電熱恒溫水浴鍋：上海梅香儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 石斛花金柚幼果果酒工藝流程

原料選取→果皮果肉打漿、護色→酶解→過濾→脫苦→滅酶→加入石斛花水提液、配料→調整糖度和pH→接種→發酵→過濾→加入石斛花→二次發酵→離心→調配→裝瓶→滅菌→成品

1.3.2 操作要點

原料選取：選取金柚幼果落果和質量佳的新鮮鐵皮石斛花，并且清洗干凈。

打漿：將清洗好的果皮、果肉切丁，放入攪拌機，以果皮果肉和水1∶2（g∶mL）的比例加入飲用水，用攪拌機將果皮打漿。加入0.1%的偏重亞硫酸鉀進行護色殺菌。

酶解：采用纖維素酶和果膠酶復合酶解，向果漿中加入0.20%果膠酶和0.03%纖維素酶，在50 ℃條件下酶解50 min。酶解后的果漿用4層紗布過濾，收集果汁。

脫苦、滅酶：向果汁中分別加入2.5%的β-環糊精，在45 ℃條件下恒溫水浴100 min。把脫苦后的果汁加熱至65 ℃保溫30 min，后冷卻至30 ℃備用。

浸提石斛花：將鐵皮石斛花和水按1∶10（g∶mL）料液比在75 ℃水浴浸提30 min，過濾，收集濾液，重復3次，合并3次浸提過濾得的浸提液。以果汁∶石斛花浸提液=1∶1（V∶V）的比例混合。

成分調整：測混合液糖度，加白砂糖調整初始糖度為24%。測混合液pH值，用檸檬酸調整pH值為4.0。

酵母活化、接種：在30～37 ℃條件下活化酵母15 min。按照0.07%的接種量把酵母加入混合液中。發酵前2 d用紗布蓋口，使酵母有氧呼吸，充分繁殖。之后采用密閉式發酵，發酵7 d。整個過程控制發酵溫度在22 ℃。

二次發酵：發酵結束后，用4層紗布過濾果酒，除去殘渣。以1∶10（g∶mL）的比例，把石斛鮮花加入過濾后的果酒，放在2 ℃的環境下，使其二次發酵，后熟。

離心處理：把果酒裝入離心管，放入離心機，在3000r/min條件下離心10 min，再收集上層清液。

后期調味：對果酒的酒精度和酸度調配，使其酒味更佳；再將果酒倒入已經滅菌的玻璃瓶中，密封，使其在70 ℃下水浴恒溫20 min。

1.3.3 原料處理方法的確定

果皮榨漿后，向果漿中分別加入不同添加量（0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）的果膠酶以及0.03%纖維素酶，在50 ℃條件下復合酶解50 min。由于金柚幼果中果膠含量較大，以出汁率和可溶性固形物為評價指標，探究不同果膠酶添加量對出汁率的影響。

出汁率=出汁量/原料量×100%；可溶性固形物利用手持糖度計測量。

1.3.4 脫苦方法的確定

向果汁中分別加入0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的柚苷酶，在60 ℃恒溫水浴60 min，或者向果汁中分別加入1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的β-環糊精，在45 ℃恒溫水浴100 min，然后在初始糖度為22%，pH值為4.0，接種量0.07%，發酵溫度為22 ℃的條件下發酵7 d，以感官評價為評價指標，研究兩種脫苦材料及其添加量對果酒苦味的影響[24-25]。

1.3.5 果酒發酵工藝優化單因素優化試驗

以酵母接種量（0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.11%），發酵溫度（16 ℃、19 ℃、22 ℃、25 ℃），發酵時間（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d）以及初始pH（3.6、3.8、4.0、4.2）為考察因素，通過單因素試驗考察其對果酒酒精度和感官評分的影響。

1.3.6 果酒發酵工藝優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以酒精度（Y）為響應值，以酵母接種量、發酵溫度、發酵時間以及初始pH值為影響因素，設計4因素3水平響應面試驗，優化石斛花金柚幼果果酒的發酵工藝。響應面試驗因素與水平如表1所示。

表1 石斛花金幼果功能性果酒發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine

1.3.7 指標檢測

（1）感官指標

石斛花金柚幼果果酒的感官評價主要根據色澤、風味、口感、滋味進行評分。選取10名食品專業人員對產品分別評價，取平均值作為產品的最終評分。脫苦工藝優化的感官評價標準見表2，發酵條件優化的感官評價標準見表3。

表2 金柚幼果果汁脫苦工藝優化的感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of debittering process optimization of immature pomelo juice

表3 石斛花金幼果功能性果酒發酵條件優化的感官評分標準Table 3 Sensory evaluation standards of fermentation conditions optimization of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine

（2）理化指標檢測

酒精度、總糖、還原糖、總酸：按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定。

總黃酮含量的測定：配制0.008 mg/mL、0.032 mg/mL、0.048 mg/mL、0.064 mg/mL和0.08 mg/mL的蘆丁標準溶液先加入1.4 mL 5%NaNO2搖勻，放置6 min，再加入1.4 mL 10%的Al（NO3）3，放置6 min；然后加入10 mL 1 mol/L NaOH，混勻，用體積數30%的乙醇稀釋至20 mL，10 min后于波長510 nm處測定吸光度值，繪制標準曲線。取1 mL果酒溶液，按上述步驟反應后，測其吸光度值，按照標準曲線回歸方程計算得出總黃酮得率[26]。

還原力的測定：配制0.060 mg/mL、0.065 mg/mL、0.070 mg/mL、0.075 mg/mL和0.080 mg/mL維生素C標準溶液，加入1%鐵氰化鉀1 mL，混合物在50 ℃恒溫加熱20 min，急速冷卻，加入2.5 mL10%三氯乙酸，3 500 r/min離心分離10 min。取上層清液2.5 mL，加入去離子水2.5 mL和0.5 mL 0.1%FeCl3，混合均勻，靜置10 min后在波長700 nm處測定吸光度值，繪制標準曲線。然后取1 mL樣品液，按上述步驟反應后，測其吸光度值，得出還原力能力[27]。

2 結果與分析

2.1 酶解工藝優化

果膠酶和纖維素酶通過水解金柚幼果中的果膠和纖維素，軟化果肉組織，從而提高果汁的可濾性[28-29]。果膠酶的添加量對金柚幼果出汁率影響結果見表4，可知出汁率隨著果膠酶添加量增大而增大。當果膠酶添加量＞0.20%時，出汁率的變化不明顯。因此，選取果膠酶最適添加量為0.20%。

表4 不同果膠酶添加量對金柚幼果出汁率的影響Table 4 Effects of different pectinase addition on juice yield of immature pomelo

2.2 脫苦工藝優化

通過表5可知，β-環糊精的去苦效果總體感官評分要比柚柑酶的高，因此后期選用β-環糊精來對柚子酒進行脫苦。添加不同量的β-環糊精后，感官評價結果表明，3.0%與3.5%β-環糊精添加量的感官評價分數相差不大，則說明其去苦效果相差不大。因此，選擇β-環糊精最佳添加量為3.0%。

表5 柚苷酶與β-環糊精添加量對金柚幼果果汁的去苦影響Table 5 Effect of naringinase and β-cyclodextrin addition on the debittering of immature pomelo

2.3 果酒發酵工藝優化

2.3.1 酵母接種量對石斛花金柚幼果功能性果酒品質的影響

在初始pH值為4.0、發酵溫度為22 ℃、發酵時間為7 d的條件下，觀察不同酵母接種量對石斛花金柚幼果功能性果酒的酒精度及感官評分的影響，結果見圖1。

圖1 酵母接種量對石斛花金幼果功能性果酒品質的影響Fig.1 Effect of yeast inoculum on the quality of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine

由圖1可知，當酵母接種量達到0.07%時，果酒的酒精度達到最高值；隨著酵母接種量增加至0.09%，酒精度稍微下降，感官評分達到最優值。其原因可能是酵母接種量過大，消耗在酵母菌生長繁殖上的糖量加大，用于無氧呼吸中發酵生成酒精的糖相對減少，導致酒精度降低[30]。因此，選擇最佳酵母接種量為0.09%。

2.3.2 發酵溫度對石斛花金柚幼果功能性果酒品質的影響

在初始pH值為4.0、酵母接種量為0.07%、發酵時間為7 d的條件下，觀察不同發酵溫度對石斛花金柚幼果果酒的酒精度及感官評分的影響，結果見圖2。

圖2 不同發酵溫度對石斛花金幼果功能性果酒品質的影響Fig.2 Effect of different fermentation temperatures on the quality of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine

由圖2可知，隨著發酵溫度提高至22 ℃時，果酒的酒精度和感官評分的達到最優值；當發酵溫度繼續提高，果酒的品質反而下降。其原因可能是在溫度較低時，酵母菌生理活動被抑制，代謝不旺盛，導致發酵不徹底，使酒精度過低和風味不足。當發酵溫度高于22 ℃時，酵母菌發酵過于旺盛，酒精度逐漸下降，同時酒中果香味會變淡，有少量雜氣，給果酒風味帶來負面影響。因此，選擇最佳發酵溫度為22 ℃。

2.3.3 初始pH值對石斛花金柚幼果功能性果酒品質的影響

在酵母接種量為0.07%，發酵溫度為22 ℃、發酵時間為7 d的條件下，觀察不同初始pH值對石斛花金柚幼果果酒的酒精度及感官評分的影響，結果見圖3。

圖3 不同初始pH值對石斛花金幼果功能性果酒品質的影響Fig.3 Effect of different initial pH on the quality of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine

由圖3可知，隨著初始pH值的升高，果酒的酒精度和感官評價分數都隨之提高；在初始pH為4.0時，果酒的酒精度和感官評分達到最優值；當初始pH＞4.0后，兩者開始下降。其原因可能是酵母菌適合在偏酸性的環境中生長，當初始pH過低或者過高時，酵母菌的繁殖會受到抑制，導致果酒酒精度低，果酒風味不足。綜合來看，選擇最佳初始pH值為4.0。

2.3.4 發酵時間對石斛花金柚幼果功能性果酒品質的影響

在初始pH值為4.0、酵母接種量為0.07%、發酵溫度為22℃的條件下，觀察不同發酵時間對石斛花金柚幼果果酒的酒精度及感官評分的影響，結果見圖4。

圖4 不同發酵時間對石斛花金幼果功能性果酒品質的影響Fig.4 Effect of different fermentation time on the quality of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine

由圖4可知，在剛開始發酵的3 d中，果酒中出現大量泡沫，酒質渾濁；隨著發酵時間的加長，泡沫逐漸消失，果酒開始變得澄清，酒精度逐漸升高；發酵到7 d時果酒的感官評價分數達到最優值，酒香和果香味并存；發酵至9 d、11 d時，酒精度逐漸升高，酒中存在雜氣，風味變差，感官評價分數開始降低。因此，選擇最佳發酵時間為7 d。

2.4 響應面分析法優化石斛花金柚幼果果酒發酵工藝

2.4.1 響應面試驗優化結果與分析

在單因素試驗的基礎上，以酒精度（Y）為響應值，選取酵母接種量（X1）、發酵溫度（X2）、初始pH值（X3）、發酵時間（X4）四影響因素，采用4因素3水平的響應面試驗設計，對果酒發酵的酒精度（Y）進行優化，試驗設計和結果見表6。

表6 石斛花金幼果功能性果酒發酵工藝優化響應面試驗結果與分析Table 6 Results and analysis of response surface tests for fermentation process optimization of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine

2.4.2 響應面試驗方差分析

利用Design-Expert 8.06軟件對表2數據進行二次多元回歸擬合，根據試驗結果得到二次多項回歸方程為：

對該模型進行方差分析，結果如表7所示。

表7 響應面試驗結果方差分析Table 7 Variance analysis of response surface tests results

由表7可知，根據方差分析，當數學模型P值＜0.05，呈顯著；失擬項P值＞0.05，呈不顯著時，證明該模型顯著，表明該模型可以接觸響應中的變異，模型模擬效果良好。各因素中，一次項D和二次項B2對酒精度具有顯著的影響（P＜0.05）。

方差分析結果中，決定系數R2值為0.813 5，表明模型可以解釋81.35%的響應值，可以預測大多數結果；調整決定系數R2值為0.627 0，說明試驗可進行優化，調整之后有62.70%的變化來源于試驗所考察變量。變異系數為13.04%，數據的離散程度在可接受范圍內。

2.4.3 驗證試驗

根據建立的數學模型，響應值最大時的最優條件為酵母接種量為0.09%、發酵溫度24 ℃、初始pH值為3.8、發酵時間為9 d，產品酒精度預測值為11.8%vol。為了驗證試驗結果的可靠性，根據這個最優配方做試驗，驗證模型的擬合程度。試驗結果表明，實際測得的酒精度為11.9%vol，預測值相對誤差0.84%。

2.4.4 產品質量指標

石斛花金柚幼果果酒呈亮黃色，有光澤，澄清度高，而且通過柚子和石斛花香味協調，有突出的柚子香味，石斛花柚子整體協調，入口醇香濃厚，酸甜可口，沒有苦味澀味。酒精度為11.9%vol，總糖為52.86 g/L，還原糖為39.78 g/L，總酸為2.53 g/L，總黃酮0.03 g/L，有一定的抗氧化活性，酒中菌落總數＜50 CFU/mL；大腸桿菌未檢測出。

3 結論

本試驗利用金柚幼果和石斛花為主要原料，加入0.20%果膠酶和0.03%纖維素酶酶解果漿，再以3%β-環糊精配合脫苦，所得金柚幼果出汁率、感官評分較高。通過單因素試驗和響應面試驗，得到最優石斛花金柚幼果功能性果酒的最優發酵工藝為酵母接種量0.09%、發酵溫度24 ℃、初始pH值3.8、發酵時間9 d。在此優化條件下，石斛花金柚幼果果酒的酒精度可以達到11.9%vol。最后通過理化指標檢測與市面上普通的柚子風味果酒進行對比，結果證明，石斛花金柚幼果果酒具有豐富的抗氧化物質和較優的抗氧化功能，在為消費者提供了新型產品的同時，還達到了廢棄物高利用的目的，對農業可持續發展有著重大意義。