山茱萸果酒澄清工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性

曹 力，李格格，耿連欣，趙曉玲，鄭凱心

（河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

山茱萸（Cornus officinalisSieb.Et Zucc.）為山茱萸科植物的干燥成熟果肉，別名棗皮、山芋肉。主產(chǎn)于陜西、山西、河南等省，是我國傳統(tǒng)的滋補中藥材，具有補益肝腎、收澀固脫的功效[1]，用于治療眩暈耳鳴、腰酸遺精、崩漏帶下、大汗虛脫、內熱消渴等病癥[2]。山茱萸果肉中含有環(huán)烯醚萜苷類、有機酸、鞣質、多糖、酯類等多種化學成分[3-6]，具有代表性的功能活性成分為莫諾苷、馬錢苷、齊墩果酸和熊果酸等[7-8]。山茱萸果肉中還含有豐富的礦物質元素、維生素A（vitamin A，VA）、維生素C（vitamin C，VC）及多種氨基酸成分[9-10]。現(xiàn)代藥理研究表明，山茱萸具有抗氧化、抗炎、降血糖、保護神經(jīng)及改善記憶等作用[11-12]。報道顯示，山茱萸多糖可改善大鼠的記憶、延緩衰老，扶植腸道的正常菌群的生長，促進腸道雙歧桿菌和乳桿菌的增殖，調節(jié)腸道菌群失調[13]。山茱萸多糖及山茱萸中的有機酸和酯類有很好的抗氧化作用。山茱萸的活性成分莫諾苷在抗氧化應激損傷、抑制Ca2+失衡和細胞凋亡方面具有重要的調節(jié)作用，這些作用與其降低胞內乳酸脫氫酶的釋放，抑制細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的蓄積，抑制細胞內游離Ca2+濃度增加及細胞內凋亡蛋白“Caspase-3”的表達有關[14]。以上研究成果提示，山茱萸在保健品和藥品領域的開發(fā)和應用具有廣闊的前景。

山茱萸在我國被列入藥食同源目錄，故其是保健食品的重要原料來源。利用山茱萸果肉加工釀制而成的果酒，具有酒度低、風味獨特、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點[10]。然而，由于生產(chǎn)原料本身及生產(chǎn)工藝等因素的影響，山茱萸果酒在貯藏過程中，易產(chǎn)生渾濁和沉淀，影響果酒的品質。果酒的穩(wěn)定性較差，易出現(xiàn)渾濁沉淀。果酒沉淀的形成與酒中的微生物、大分子物質和金屬離子有關[15]。果酒沉淀形成的機制較為復雜，根據(jù)酒體的特性選擇合適的澄清方式，是當前消除沉淀的一種思路。果酒的澄清方法包括物理澄清法、化學澄清法及生物澄清法。物理澄清法有冷凍法和吸附法。化學沉淀法是利用澄清劑來達到澄清目的的一種方法，所選用的澄清劑有明膠、膨潤土、殼聚糖和植物型澄清劑等。有研究者嘗試將不同澄清劑配合使用，達到了更好的澄清效果[16]。生物澄清法是利用酶制劑對果膠等物質水解而使果酒澄清的一種方法。研究表明[17-18]，采用果膠酶澄清工藝對果汁能夠達到較好的澄清效果。本研究采用果膠酶對山茱萸果酒進行澄清處理，在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優(yōu)化澄清工藝，并以1,1-二苯基硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基（DPPH·）、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）自由基（ABTS+·）、羥基自由基（·OH）清除率分析其抗氧化活性，以期為山茱萸深加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

山茱萸果酒：本實驗室自釀；果膠酶（酶活2萬U/g）：上海藍季生物有限公司；DPPH、ABTS：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

SKG A9打漿機：廣東艾詩凱奇智能科技有限公司；LAL2T型折光儀：廣州市速為電子科技有限公司；722分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；PHS-2F pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；JA5003N電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；SPL-250恒溫培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 山茱萸果酒的澄清

在山茱萸果酒中加入不同添加量的果膠酶，在不同的酶解溫度和時間條件下進行果酒的澄清，取澄清液進行澄清度檢測，以考察各因素對澄清效果的影響。

1.3.2 澄清度的檢測

采用分光光度法，以蒸餾水作為空白，在波長550 nm處用1 cm比色杯測其透光率（%），用透光率表示果酒的澄清度。測定前，將處理后的果酒在3 500 r/min條件下離心10 min，取上層澄清液測其透光率。

1.3.3 澄清工藝優(yōu)化單因素試驗

果膠酶用量：取5份10 mL的山茱萸果酒置于試管中，分別按0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的添加量將果膠酶添加于盛有果酒的試管中，充分混勻后，在40 ℃的恒溫水浴鍋中酶解120 min，然后測其透光率，分析果膠酶用量對山茱萸果酒澄清度的影響。

酶解溫度：取5份10 mL的山茱萸果酒置于試管中，加入0.04%的果膠酶，酶解時間120 min，分別在30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃的溫度條件下，進行澄清試驗，分析酶解溫度對山茱萸果酒澄清度的影響。

酶解時間：取5份10 mL的山茱萸果酒置于試管中，加入0.04%的果膠酶，分別固定酶解時間為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，分析酶解時間對山茱萸果酒澄清度的影響。

1.3.4 澄清工藝優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，進一步優(yōu)化山茱萸果酒酶解澄清工藝條件。選擇變量因素果膠酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）作為變量因子，設計3因素3水平正交試驗。正交試驗因素編碼和水平見表1。

表1 澄清工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for clarification process optimization

1.3.5 山茱萸果酒感官指標、理化指標和微生物指標檢測

感官指標：山茱萸果酒的感官評分標準見表2。參考相關報道方法[19]，從色澤、香氣、風味和口感對山茱萸果酒進行打分，取10位專家評分的平均值為最終分值，滿分100分。

表2 山茱萸果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of dogwood fruitwine

理化指標：山茱萸果酒的酒精度含量按照GB5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測度》中方法測定；基本指標按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》規(guī)定的方法測定。

微生物指標：菌落總數(shù)按照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》規(guī)定方法進行測定；大腸菌群按照GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》規(guī)定方法進行測定。

1.3.6 山茱萸果酒的抗氧化能力檢測

參照賀江等[20]報道的方法，檢測山茱萸果酒對DPPH·、ABTS+·及OH·的清除能力。

將DPPH配制成100 μmol/L的DPPH-乙醇工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。取100 μL的果酒樣加入離心管中，之后加500 μL DPPH-乙醇工作液，以蒸餾水代替酒樣設空白組，無水乙醇代替DPPH-乙醇工作液設對照組，以VC溶液為陽性對照組，加DPPH-乙醇工作液后，充分混勻，避光靜置30 min。測定517 nm波長條件下的吸光度值。每個樣品重復3次樣品DPPH·的清除率計算公式如下：

式中：A1為果酒樣組或VC組的吸光度值；A2為對照組吸光度值；A0為空白組吸光度值。

將5 mL ABTS（7 mmol/L）溶液與2.5 mL K2S2O8（7.35 mmol/L）混合后避光反應12 h，取1 mL反應液用0.2 mol/L的PBS稀釋，直至稀釋液在734 nm波長處的吸光度值為0.7±0.03，制得ABTS工作液。取100 μL的果酒樣加入離心管中，之后加500 μL ABTS工作液，以蒸餾水代替酒樣設空白組，以蒸餾水代替ABTS工作液設對照組，以VC溶液為陽性對照組，加ABTS工作液后，充分混勻，反應10 min，測定734 nm波長條件下的吸光度值。每個樣品重復3次。樣品ABTS+·的清除率計算公式如下：

式中：A1為果酒樣組或VC組的吸光度值；A2為對照組吸光度值；A0為空白組吸光度值。

取100 μL的果酒樣加入離心管中，與60 μL濃度為0.04 mol/L的H2O2混合后，再加入240 μL 0.1 mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液，以蒸餾水代替酒樣設空白組，以蒸餾水代替H2O2設對照組，以VC溶液為陽性對照組，加H2O2后，充分混勻，避光靜置10 min，測定230 nm波長條件下的吸光度值。每個樣品重復3次。樣品OH·的清除率計算公式如下：

式中：A1為果酒樣組或VC組的吸光度值；A2為對照組吸光度值；A0為空白組吸光度值。

2 結果與分析

2.1 果膠酶用量對山茱萸果酒澄清度的影響

不同果膠酶添加量對山茱萸果酒澄清效果的影響結果見圖1。

圖1 不同果膠酶添加量對果酒透光率的影響Fig.1 Effect of different pectinase addition on thetransmittance of fruit wine

由圖1可知，不添加果膠酶時，山茱萸果酒的透光率僅為72.9%。隨著果膠酶的添加量在0.01%～0.04%范圍內的增大，果酒的透光率不斷升高。當果膠酶的添加量＞0.04%時，果酒的透光率增加變緩。當果膠酶的添加量＜0.04%時，由于果膠酶能與底物有效作用，加速了酶促反應，使果酒的透光率增加迅速，當酶的添加量＞0.04%時，酶促反應速率降低，從而導致酶解效果不明顯[21]，則使果酒透光率增加緩慢。因此，選用果膠酶的最佳添加量為0.04%。

2.2 酶解溫度對山茱萸果酒澄清度的影響

不同酶解溫度對山茱萸果酒澄清度的影響結果見圖2。

圖2 不同酶解溫度對果酒透光率的影響Fig.2 Effect of different enzymatic temperature on the transmittance of fruit wine

由圖2可知，隨著酶解溫度在30～50 ℃范圍內的升高，山茱萸果酒的透光率先升高后降低。酶解溫度低于40 ℃時，酶活力隨著溫度升高而增強，當酶解溫度高于40 ℃之后，果膠酶的活性反而下降。由于酶是一種蛋白質，隨著溫度進一步升高，酶發(fā)生了變性，導致活性下降。在酶解溫度為40 ℃時，透光率最高。因此，選用最適酶解溫度為40 ℃。

2.3 酶解時間對山茱萸果酒澄清度的影響

不同酶解時間對山茱萸果酒澄清度的影響結果見圖3。

圖3 不同酶解時間對果酒透光率的影響Fig.3 Effect of different enzymatic time on the transmittance of fruit wine

由圖3可知，果酒的澄清度隨著酶解時間在30～150 min范圍內的延長而提高，在60～120 min的酶解過程中，果酒的透光率迅速升高，在120～150 min的酶解過程中，透光率增加幅度緩慢。這是由于當酶解時間＜120 min時，酶解反應較充分，透光率則呈不斷上升的趨勢；當酶解時間＞120 min之后，底物基本分解完畢，酶解反應也趨于結束，透光率增幅趨緩。因此，選取最佳酶解時間為120 min。

2.4 果膠酶澄清山茱萸果酒工藝優(yōu)化正交試驗結果

澄清工藝優(yōu)化正交試驗結果見表3，正交試驗結果的方差分析見表4。由表3可知，以澄清度作為評價指標，根據(jù)極差大小結果可知，各因素對山茱萸果酒澄清效果影響的次序為B（酶解溫度）＞C（酶解時間）＞A（果膠酶添加量）。從表中的9次試驗結果可以直接看出，A2B2C3的透光率最高，為91.6%，而由極差分析得出的最優(yōu)澄清效果方案為A2B2C2，對這一條件進行驗證，測定透光率為92.3%。因此，選取A2B2C2為最佳澄清工藝條件，即果膠酶添加量為0.04%，酶解溫度為40 ℃，酶解時間為120 min。由表4可知，酶解溫度、酶解時間和酶的添加量皆可顯著影響山茱萸果酒的澄清度（P＜0.05）。

表3 澄清工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for clarification process optimization

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

2.5 山茱萸果酒的感官分值、理化指標和微生物指標

在果膠酶最佳澄清工藝條件下，山茱萸果酒呈深紅色，有光澤，清亮透明；有典型的山茱萸果香；總體協(xié)調柔和，余味悠長；入口柔軟平和，無尖澀和苦味，具有獨特風格；山茱萸果酒的感官評分為94分。

山茱萸果酒的理化指標如表5所示，所測理化指標均達到相關國標對果酒的要求。

表5 山茱萸果酒的理化指標測定結果Table 5 Determination results of physicochemical indicators of dogwood wine

山茱萸果酒微生物指標測定結果：菌落總數(shù)＜20 CFU/mL，大腸桿菌群＜3MPN/100mL，致病菌未檢出。其微生物指標符合相關國標要求。

2.6 山茱萸果酒的抗氧化活性

山茱萸果酒的抗氧化活性檢測結果見表6。由表6可知，其對DPPH·（清除率80.62%）、ABTS+·（清除率82.22%）及OH·（清除率85.07%）均有較好的清除能力。許多果實中因含有多酚類物質而表現(xiàn)出抗氧化活性[22-23]，山茱萸中含有多酚類或環(huán)烯醚萜類物質[24]，此兩類物質成分具有一定的抗氧化活性，山茱萸中含量較大的成分馬錢苷和莫諾苷也具有抗氧化活性[25]，這些活性物質可能在果酒發(fā)酵過程中得到很好的保留，所以使得果酒具有很好的抗氧化活性。另據(jù)姚瑞祺等[19]報道，山茱萸果酒含有較高濃度的多酚類物質，故其具有很好的抗氧化活性，能有效清除自由基。結果表明，山茱萸果酒具有一定的健康保健作用。

表6 山茱萸果酒的抗氧化活性結果分析Table 6 Results and analysis of antioxidant activity of dogwoodfruit wine

3 結論

本試驗采用果膠酶研究了其山茱萸果酒的澄清效果，通過單因素試驗和正交試驗對試驗條件進行了優(yōu)化，得出的最佳澄清工藝條件為果膠酶用量0.04%、酶解溫度40 ℃、酶解時間120 min，在此最佳酶解工藝條件下，果膠酶的澄清效果明顯，透光率達到92.3%，澄清效果明顯且感官評分較高。果膠酶的添加量、酶解溫度及酶解時間都對山茱萸果酒的澄清效果產(chǎn)生了顯著的影響，3種因素對澄清效果的影響順序為：酶解溫度＞酶解時間＞酶添加量。抗氧化活性試驗結果還顯示，山茱萸果酒（100 mL）對DPPH·、ABTS+·及OH·的清除率分別為80.62%、82.22%和85.07%，表明其具有較好的抗氧化能力和健康促進作用。