發酵食品中多種防腐劑檢測方法的建立

成 祝，劉 潔，冉 琴，鄧 星，羅 蓓，蘇小東

（重慶科技學院 化學化工學院，重慶 401331）

發酵食品是指人們利用有益微生物加工制造的一類食品，日常食用的發酵食品主要有谷物發酵制品、豆類發酵制品和乳類發酵制品，其富含氨基酸、多肽、蛋白質、糖類等營養物質，對人體健康有很大的益處[1]。發酵食品因存在多種細菌等，保質期一般較短，為延長食品的保質期，往往會在加工過程中加入一些食品防腐劑。

苯甲酸和山梨酸是最常用的食品防腐劑，但過多食用苯甲酸和山梨酸會影響人體對維生素和鈣的吸收，加重人體肝臟負擔，并引起毒癥反應或誘發癌癥[2-3]。因此國家標準[4]對苯甲酸、山梨酸的使用范圍與限量做了嚴格規定。

新近研究發現苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）[5]可以有效的防止食物腐敗變質，而且對多種食源性致病菌都有很強的抑菌作用[6]，可作為一種廣譜的殺菌劑、天然新型防腐劑用于食品防腐保質。同時有研究者[7]發現，苯乳酸與防腐劑聯合作用，可以有效的減少食品中人工合成防腐劑的添加量，減少人工防腐劑對人體的危害。天然防腐劑苯乳酸復合其他人工合成防腐劑使用將成為食品防腐的發展趨勢。

目前，苯甲酸和山梨酸的檢測方法主要包括氣相色譜法（gas chromatography，GC）[8-10]、毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）[11]、高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）[12-15]、液相色譜-質譜聯用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[16]、液相色譜-三重四極桿質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[17]、液相色譜-飛行時間質譜法（liquid chromatography-time of flight-mass spectrometry，LCTOF/MS）[18-19]和表面增強拉曼光譜法（surface enhanced raman spectroscopy，SERS）[20]等。但同時檢測苯乳酸和其他食品防腐劑還未報道。本研究利用高效液相色譜法（HPLC），通過簡單的樣品前處理建立了一種同時、簡便、快速檢測發酵食品中苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的高效液相色譜的分析方法，以期將該方法運用于多種發酵食品檢測，為苯乳酸與苯甲酸與山梨酸的復配提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1～9號樣品：市售；醋酸銨（分析純）、山梨酸（純度99%）：上海麥克林生化有限公司；苯甲酸（純度99%）、三氟乙酸（純度＞99.5%）：上海源葉生物有限公司；苯乳酸（純度98%）：阿拉丁控股集團有限公司；乙酸鋅（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、甲醇（色譜純）：成都科隆有限公司；磷酸三鈉（分析純）：川東化學集團有限公司；磷酸二氫鈉（分析純）：北京康普惠威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

福立LC5090 高效液相色譜色譜儀：浙江福立分析儀器股份有限公司；ATY124分析天平：日本島津公司；T9紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；SB-120D超聲清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜分析條件

色譜柱：采用SapphiresilTM C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：0.020 mol/L乙酸銨（pH=6.4）-甲醇溶液（80∶20，V/V）；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；進樣方式：滿環進樣；色譜柱溫度：25 ℃，檢測器：紫外（ultraviolet，UV）檢測器。

1.3.2 樣品前處理

（1）含蛋白質的樣品

參照王淼等[21]的方法并做修改，準確稱取2.5 g樣品于25 mL比色管中，分別加入0.25 mol/L亞鐵氰化鉀溶液和0.50 mol/L乙酸鋅溶液各1.0 mL，用10%甲醇-水定容，振蕩2.0 min，混勻，取10 mL溶液4 000×g離心5.0 min，取上層清液過0.22 μm聚醚砜濾膜，待上機。

（2）其他樣品

準確稱取2.5 g樣品于25 mL比色管中，用10%甲醇-水定容至10 mL，渦旋振蕩2.0 min，混勻，取上層清液過0.22 μm聚醚砜濾膜，待上機。

1.3.3 方法驗證

在確定的色譜條件下，以苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的質量濃度為橫軸（X），峰面積為縱軸（Y），配制質量濃度2.00 mg/L、5.00 mg/L、10.00 mg/L、20.00 mg/L、30.00 mg/L、40.00 mg/L、50.00 mg/L的混合標準溶液并繪制標準曲線，從而評估方法的線性度。將混合標準溶液不斷稀釋至信噪比S/N=3，以此進樣濃度為檢出限（limit of detection，LOD），以10倍信噪比對應的濃度為定量下限（LOQ）。以原生醋做加標回收率實驗，通過計算回收率考察方法的準確度，以回收率的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）考察方法的精密度。在原生醋樣品中添加混合標準溶液，加標水平分別為5.00 mg/L、10.00 mg/L、20.00 mg/L，每個添加水平平行測定6 次，加標回收率計算公式如下：

式中：Csm表示加標檢測值，mg/L；Cm表示樣品檢測值，mg/L；Cs表示加標量，mg/L。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長

液相色譜配備紫外檢測器進行分析測試時，選擇分析物的最大吸收波長作為檢測波長是不必要的[22]，但待分析物在檢測波長下要求有較強的吸收。同時波長選擇與流動相有一定的關系，如含甲醇的流動相不能在波長低于210～220 nm檢測，這取決于甲醇的濃度[22]。苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的紫外吸收光譜圖見圖1。由圖1可知，3種待測物都有紫外吸收，且各組分的最大吸收波長不同，但3種防腐劑在波長220 nm處均有較強紫外吸收，為均衡3種防腐劑的檢測靈敏度，選擇220 nm作為檢測波長。

圖1 苯乳酸、苯甲酸及山梨酸的紫外吸收光譜圖Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of phenyllactate,benzoic acid and sorbic acid

2.1.2 流動相

實驗考察了甲醇-混合磷酸鹽（0.010 mol/L NaH2PO4+0.010 mol/L Na2HPO4，pH=6.8）（5∶95，V/V）、甲醇-三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（0.020 mol/L TFA，pH=2.1，氨水調節pH為6.1）（5∶95，V/V）、甲醇-乙酸銨（0.020 mol/L，pH=6.4）（5∶95，V/V）等流動相對分離效果的影響。當使用第1種流動相時，苯乳酸未出峰；使用第2種流動相時，苯甲酸未出峰。前兩種流動相未實現苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的同時檢測。當使用甲醇-乙酸銨（20∶80，V/V）為流動相時，檢測靈敏度高，分離度均＞1.5，峰形尖銳。因此，選擇流動相為甲醇-0.020 mol/L乙酸銨（20∶80，V/V）。

2.1.3 色譜分離條件

采用C18色譜柱分離，通過單因素法對各種色譜條件進行了優化。甲醇比例增加，會使流動相的極性減小，并能增加溶質分子與溶劑分子之間相互作用的強度[22]。改變流動相中甲醇和乙酸銨溶液的比例，發現隨著甲醇比例增加，3種待測物的保留時間變短；在1.0～1.2 mL/min范圍內改變流速，22～40 ℃內改變柱溫，0.010～0.050 mol/L范圍內改變乙酸銨溶液的濃度，4.0～7.0范圍內改變乙酸銨溶液的pH值進行條件優化。結果表明，當乙酸銨流動相pH值為6.4，濃度為0.020 mol/L，柱溫為25 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測靈敏度高，3種待測物分離度＞1.5，峰形較好，在12 min內可實現色譜的分離檢測，高效液相色譜圖見圖2。

圖2 苯乳酸、苯甲酸及山梨酸混標的高效液相色譜Fig.2 HPLC chromatography of mixed standards of phenyllactate,benzoic acid and sorbic acid

2.2 濾膜的選擇

實驗考察了水系濾膜與有機系濾膜對苯乳酸、苯甲酸和山梨酸的影響。以10.00 mg/L的混合標樣作為待過濾液，分別用0.22 μm聚醚砜濾膜、0.22 μm尼龍濾膜過濾后上機檢測，檢測結果見圖3。由圖3可知，尼龍濾膜的回收率在105.00%～110.00%，而聚醚砜濾膜的回收率在100.00%～105.00%，準確度更高。因此，選擇0.22 μm聚醚砜濾膜進行樣品過濾。

圖3 不同濾膜對回收率的影響Fig.3 Effect of different membranes on recovery

2.3 方法的線性范圍、檢出限及定量限

由表1可知，在優化條件下，苯甲酸線性范圍為0.010～50.00 mg/L，苯乳酸為0.075～50.00 mg/L，山梨酸為0.050～50.00 mg/L，且相關系數R2均≥0.998，檢出限在0.010～0.050 mg/L，定量限在0.025～0.25 mg/L，表明該方法提供具有寬線性范圍的靈敏檢測。

表1 三種防腐劑分析的線性范圍、相關系數、回歸方程、檢出限及定量限Table 1 Linear range,correlation coefficient,regression equation,detection limit and quantitation limit of three kinds of preservatives

2.4 樣品加標回收率試驗

為了驗證方法的準確性，本研究選取7號樣品（某原生醋）作為加標回收試驗。分別向樣品中加入5.00 mg/L、10.00 mg/L、20.00 mg/L不同質量濃度的苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的混合標樣，混勻，經過樣品前處理后測定其回收率。每個添加水平平行測定6次，其結果見表2。

表2 加標回收率試驗結果Table 2 Results of adding standard recovery tests

由表2可知，該方法的回收率為96.93%～118.42%，精密度實驗結果相對標準偏差（RSD）為0.93%～6.21%，說明方法的準確度和精密度較高，此方法的精密度和準確度符合實際樣品的檢測要求。

2.5 樣品中防腐劑的檢測

應用所建立的方法對市售的幾種樣品進行檢測，檢測結果見表3。該檢測結果對比GB7718—94《食品標簽通用標準》[23]，樣品（1～3，7～8號）存在檢出與樣品標簽不符的情況，但對比國標GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》[4]，樣品中苯甲酸與山梨酸檢出值均未超過添加限（1.00 g/kg）。其中1～3號樣品有包裝袋上未標注的苯甲酸檢出，7～8號樣品有包裝袋上未標注的苯甲酸、山梨酸檢出。

表3 發酵食品樣品中三種防腐劑檢測結果Table 3 Determination results of three kinds of preservatives in fermented food samples

由表3可知，發酵食品樣品里都含有不同程度的防腐劑，一般都含有天然的防腐劑——苯乳酸。據文獻報道，某些食品在發酵過程中會自身產生苯甲酸（內源性苯甲酸），故不能確定檢出的苯甲酸是否為外源性苯甲酸，但山梨酸應屬于人為添加。

3 結論

本實驗建立了HPLC快速檢測食品中苯乳酸、苯甲酸、山梨酸，以分析標準品與樣品的保留時間對應定性。在優化的色譜條件下，3種防腐劑在12 min之內完成分離檢測，檢出限在0.010～0.050 mg/L之間，定量限在0.025～0.25 mg/L，回收率為96.93%～118.42%，精密度實驗結果相對標準偏差為0.39%～6.21%。該方法檢測速度快、所需設備簡單、無需復雜的樣品前處理。