響應面法優化多依果酒的釀造工藝

黃艷麗，尹錦榮，王 瓊，虞志君，袁其敏，楊超凡，趙 秀

（云南農業大學 熱帶作物學院，云南 普洱 665000）

多依果（Docynia delavayi fruit）又稱栘衣果、酸蘋果，是薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）栘[木衣]屬（Docynia）熱帶經濟作物云南栘（Docynia delavayi（Franch.）Schneid.）的果實。云南栘主要分布于亞洲，在我國產于云南、貴州、四川等西南各地[1-2]。多依營養豐富，食藥兩用[3]，其富含多種氨基酸，具有健胃消食和抗疲勞的作用[4-5]；且其還是一味傣藥，含有黃酮類[6-13]、多酚類[14-15]等活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化和治療心血管病的藥用價值[16]。多依果是云南省極具地方特色的熱帶水果，當地人大量采摘食用，栘依產業對提高山區農民收入和生活水平具有重要的意義。

多依果中粗纖維和植物單寧含量較高，生吃時質地酸澀[15]，使得外地受眾較少，因而造成了多依果資源的大量浪費。目前，受限于地域環境特征，關于多依果產品的研究開發，報道較少[17]。朱明君等[18]通過人工接種冠突散囊菌（Eurotium cristatum）固態發酵多依果茶飲料，并研究發現發酵后果茶的呈味氨基酸和人體必需氨基酸質量分數升高，這表明通過發酵可以改變多依果鮮果的粗渣口感；冀智勇等[19-20]對多依果的營養成分進行了研究，并在此基礎上介紹了多依腌制果、果醬、果脯、果角、果片、果飲料、果醋、果酒的粗加工工藝，但加工方法簡單，且沒有對工藝參數進行優化。多依果在民間的酒釀歷史悠久，但受到技術水平的限制，風味口感各異，難以大規模推廣。因此，研究多依果酒的釀造工藝并加以科學優化，既可以將多依果的營養成分保存到果酒中，豐富果酒品種，又可充分利用多依果的野生資源，進而推動多依果產業的現代化發展。

酵母菌生長繁殖的適宜溫度為20～25 ℃左右。受亞熱帶季風氣候影響，多依果主產地普洱市四季如春，在10～12月份多依果成熟采摘期時日溫差約為18～26 ℃，因此，當地多依果酒釀制多選擇自然溫度發酵。本研究以多依果為原料，室溫（18～26 ℃）發酵多依果酒，以酒精度、可溶性固形物含量及感官評分為評價指標，在單因素試驗的基礎上，通過響應面法優化多依果酒的釀造工藝參數，旨在釀造一款具有多依果典型香氣和富含其多種營養成分的果酒，為多依果產品的開發以及多依果酒的產業化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多依果（黃熟期）：云南普洱農貿市場；安琪果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（10 000 U/mL）：諾維信生物有限公司；白砂糖（食品級）：深圳安泰生物科技有限公司；焦亞硫酸鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ME204E分析天平：美國METTLER TLLEDO公司；HC-3618R高速冷凍離心機：安徽中科中佳公司；LH-B55數顯折光儀：杭州陸恒生物科技有限公司；PB-10酸度計：北京賽多利斯科學儀器有限公司；GMK-702R糖度測定儀：北京西諾遠大科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多依果酒釀造工藝流程及操作要點

操作要點：

原料預處理：挑選無病蟲害、無霉變、無破損的黃熟期多依果，洗凈，晾干。

切塊、打漿：鮮果稱質量，切塊，按料液比2∶1（g∶mL）加水，混合打漿。

酶解：添加0.2%的果膠酶于果漿中，室溫酶解6 h。

糖度調整：添加試驗所需白砂糖量，以達到果酒發酵所需的酒精度要求。

殺菌：添加試驗所需的二氧化硫進行滅菌。

酵母活化：稱取試驗所需酵母菌用量，加入5 mL無菌水，在35 ℃條件下水浴活化30 min，備用。

接種發酵：將活化后的酵母液接入到發酵罐中酶解后的果漿中，室溫發酵，并且定期攪拌排氣。

過濾、陳釀：發酵液紗布過濾，酒液密封陳釀1～2個月，得多依果酒。

1.3.2 多依果酒釀造工藝優化單因素試驗

根據預試驗結果確定初始發酵條件為白砂糖添加量24%、二氧化硫添加量6%、酵母菌添加量3%，室溫（日溫差18～26 ℃）發酵7 d。在此基礎上，分別改變白砂糖添加量（20%、22%、24%、26%、28%）、二氧化硫添加量（4%、5%、6%、7%、8%）、酵母菌接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、發酵時間（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d），測定多依果發酵液的酒精度及可溶性固形物含量，并進行感官評定。

1.3.3 多依果酒釀造工藝優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，確定發酵時間為6 d，選取對多依果發酵液酒精度、感官評分具有顯著性影響的因子白砂糖添加量（A）、二氧化硫添加量（B）和酵母菌接種量（C）作為考察因素，酒精度（Y）為響應值進行3因素3水平的響應面優化試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 多依果酒釀造工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of Docynia delavayi fruit wine

1.3.4 測定方法

（1）理化指標

酒精度：參考GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中酒精計法測定；總糖、總酸含量：分別參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定、酸堿滴定法測定；可溶性固形物含量：參考GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中折光計法測定。

（2）微生物指標

菌落總數：參考GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》測定；大腸菌群計數：參照GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數》測定。

（3）感官評價

根據多依果果酒的特點，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中感官檢查與評定方法和標準，制定多依果感官評分標準，并組建感官評定小組20人進行感官評分，取其平均值為評分結果。感官評分標準見表2。

表2 多依果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of Docynia delavayi fruit wine

1.3.5 數據分析

采用Design-Expert 10進行響應面試驗設計與分析，采用Origin 2008進行數據處理和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 多依果酒釀造工藝優化單因素試驗

2.1.1 白砂糖添加量對多依果酒發酵的影響

白砂糖添加量對多依果酒發酵的影響見圖1。由圖1可知，白砂糖添加量在20%～28%的范圍內，隨著白砂糖添加量的逐漸增加，多依果酒的酒精度和感官評分均呈現先增高后下降的趨勢，可溶性固形物含量則呈現先持平后升高的趨勢。當白砂糖添加量＜24%之前，白砂糖添加量過低，發酵不充分，導致果酒的酒精度偏低，且口感發澀，感官評分偏低；當白砂糖添加量為24%時，果酒的酒精度達到最高（7.30%vol），此時酒液感官評分也是最佳（96分）；而當白砂糖添加量＞24%之后，可溶性固形物含量急劇上升，殘糖量過多，反而不利于酵母菌的繁殖，導致果酒的酒精度下降，而且過甜的口感也使得感官評分不高。因此，確定最佳的白砂糖添加量為24%。

2.1.2 二氧化硫添加量對多依果酒發酵的影響

二氧化硫在果酒發酵過程中起到殺菌、保鮮、提高其口感質量的作用。二氧化硫添加量對多依果酒發酵的影響見圖2。

圖2 二氧化硫添加量對多依果酒發酵的影響Fig.2 Effect of SO2 addition on Docynia delavayi fruit wine fermentation

由圖2可知，二氧化硫添加量在4%～8%的范圍內，對多依果酒的酒精度影響較小，酒精度、感官評分及可溶性固形物含量均呈現先上升后下降的趨勢。當二氧化硫添加量為5%時，酒精度達到最大（8.32%vol），此時果酒感官評分也最高（97分）；當二氧化硫添加量＞5%之后，二氧化硫含量過高，酵母菌的活性受到抑制，可溶性固形物含量增加，感官評分降低。因此，確定最佳二氧化硫添加量為5%。

2.1.3 酵母菌接種量對多依果酒發酵的影響

酵母菌接種量對多依果酒發酵的影響見圖3。由圖3可知，酵母菌接種量在1%～5%范圍內，隨著酵母菌接種量的逐漸增加，多依果酒的酒精度呈現先增高后平緩的趨勢，感官評分呈現下降趨勢，可溶性固形物含量呈現先快速下降后平緩的趨勢。當酵母菌的接種量＜3%之前，其接種量與果酒的酒精度呈正相關。當酵母菌接種量為3%時，酒精度最高達到9.48%vol。但當酵母菌接種量＞3%之后，其本身需要消耗果肉的營養物質，導致酒精轉化率下降[21]。而且酵母菌的接種量在一定程度上影響了果酒的果香味，使得感官評分一直下降。因此，綜合評價酵母菌的最佳接種量為3%。

圖3 酵母菌接種量對多依果酒發酵的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on Docynia delavayi fruit wine fermentation

2.1.4 發酵時間對多依果酒發酵的影響

發酵時間對多依果酒發酵的影響見圖4。

圖4 發酵時間對多依果酒發酵的影響Fig.4 Effect of fermentation time on Docynia delavayi fruit wine fermentation

由圖4可知，隨著發酵時間（5～9 d）的延長，酒精度和可溶性固形物含量整體趨于平緩，感官評分呈現先上升后下降的趨勢。當發酵時間為6 d時，酒精度達到最大（8.48%vol），此時酒液感官評分也最高（98分）。發酵時間過長，果香味變淡，感官評分逐漸下降。因此，確定最佳發酵時間為6 d。

2.2 多依果酒釀造工藝優化響應面試驗

2.2.1 回歸模型的建立與方差分析

根據單因素試驗結果，確定室溫（18～26 ℃）發酵6 d，選用酒精度（Y）為響應值，以白砂糖添加量（A）、二氧化硫添加量（B）、酵母菌接種量（C）為考察因素，進行3因素3水平的響應面試驗，試驗設計與結果見表3，方差分析見表4。

表3 多依果酒釀造工藝優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation technology optimization of Docynia delavayi fruit wine

利用Design Expert 10軟件對表3的結果進行多元回歸擬合分析，得到二次多元回歸方程：

Y=9.260-0.220A+0.100B+0.365C+0.180AB-0.010AC-0.110BC-0.635A2+0.045B2+0.015C2

由表4可知，該模型的P值＜0.000 1，極顯著，說明所得方程有意義；失擬項P值＞0.05，不顯著，說明所構建的模型很好，與試驗的差異較小；相關系數R2為0.950 4，調整系數R2adj為0.956 2，差值＜0.2，說明預測值與試驗值有較好的相關性，試驗誤差較小；模型的信噪比為21.788，遠大于4，則表明該模型適合用于多依果酒釀造工藝和酒精度的預測。在該模型中，一次項A、C、交叉項AB和二次項A2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項B對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。根據F值大小可知，各因素對多依果酒酒精度影響的主次順序為：酵母菌接種量（C）＞白砂糖添加量（A）＞二氧化硫添加量（B）。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應面分析

對多依果酒的酒精度產生影響的各因素兩兩交互作用的響應面及等高線見圖5。由圖5a可知，響應曲面傾斜度很高，等高線呈橢圓形，說明白砂糖添加量和二氧化硫添加量的交互作用對多依果酒的酒精度有極其顯著性影響。由圖5b可知，響應曲面有傾斜度，等高線趨于圓形，說明白砂糖添加量和酵母菌添加量的交互作用對酒精度的影響較小。由圖5c可知，響應曲面傾斜度不高，等高線接近橢圓形，說明二氧化硫添加量和酵母菌添加量的交互作用對酒精度有影響，但沒有達到顯著性水平（P＞0.05）。

結合以上結果分析，根據回歸方程對試驗結果進行優化，得到多依果酒的最優釀造條件為：白砂糖添加量23.69%，二氧化硫添加量4.51%，酵母菌接種量3.97%，在此工藝條件下，室溫（18～26 ℃）發酵6 d，多依果酒的酒精度理論值為9.74%vol。根據實際情況，將工藝參數修正為：白砂糖添加量23.7%，二氧化硫添加量4.5%，酵母菌接種量4.0%，按修正后的工藝參數值進行模型的驗證試驗，得到多依果果酒的實際酒精度為9.82%vol，與理論值接近，說明采用響應面法優化多依果酒釀造工藝條件是準確可行的，該模型有一定的應用價值。

圖5 各因素交互作用對多依果酒酒精度影響的響應面及等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on alcohol content in Docynia delavayi fruit wine

2.3 多依果酒的質量指標測定結果

對按最優工藝參數制備的多依果酒進行感官評價和部分質量指標測定。感官評定結果表明，多依果酒體具有多依果特征香氣，與酒香混為一體，色澤為黃橙色，口感醇和，感官評分為98分。質量指標結果表明，酒精度9.82%vol，可溶性固形物含量13.00%，總酸含量7.20 g/L，菌落總數18CFU/mL，大腸菌群＜3MPN/100mL。果酒各指標項目檢測結果均符合NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》的標準要求。

3 結論

以云南省普洱市特產的多依果為原料，酒精度、感官評分、可溶性固形物含量為評價指標，在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken響應面法設計和優化試驗，確定多依果酒的最佳釀造工藝：白砂糖添加量23.7%，二氧化硫添加量4.5%，酵母菌接種量4.0%，室溫（18～26 ℃）發酵6 d。在此最優釀造工藝條件下，多依果酒顏色呈黃橙色，果香與酒香協調，滋味醇厚，感官評分為98分。酒精度為9.82%vol，可溶性固形物含量為13.00%，總酸含量7.20 g/L，菌落總數18 CFU/mL，大腸菌群＜3 MPN/100 mL，各項指標均符合相關果酒行業標準。