基于IL-6、JAK2/STAT3信號通路探討復方當歸注射液在缺血性卒中炎性反應中的作用

李月　湯軼波　李韻歆　于雪　張巧慧　陳亞飛　白雪　馬茹　王淑艷　劉振權

〔摘要〕 目的 基于IL-6和JAK2/STAT3信號通路，探討復方當歸注射液在缺血性卒中炎性反應中的作用。方法 將大鼠隨機分為空白對照組、假手術組和造模組。采用線栓法建立大腦中動脈栓塞致局灶性缺血損傷模型，造模成功后，再將造模大鼠隨機分為模型組、復方當歸注射液組和依達拉奉組，各組給予相應藥物干預7 d，于末次給藥24 h后處死取腦組織，采用TTC染色法觀察各組大鼠的腦梗死情況;采用HE染色法觀察各組大鼠腦組織病理學情況;采用ELISA法檢測各組大鼠血漿中IL-6的含量;采用Western Blot法檢測各組大鼠腦組織中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的表達情況。結果 復方當歸注射液組可縮小缺血性卒中大鼠的腦梗死區域，減輕腦組織神經元的異常形態變化;復方當歸注射液組IL-6的含量及p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3水平均低于模型組（P<0.01）。結論 復方當歸注射液可通過降低缺血性卒中大鼠IL-6及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3的表達，抑制炎性反應，發揮神經保護作用。

〔關鍵詞〕 缺血性卒中;復方當歸注射液;炎性反應;IL-6;JAK2/STAT3

〔中圖分類號〕R285.5;R743.3? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.04.006

Discussion on the Effects of Compound Danggui Injection in the Inflammatory Reaction of

Cerebral Ischemia Stroke Based on IL-6 and JAK2/STAT3 Signaling Pathway

LI Yue1， TANG Yibo2， LI Yunxin2， YU Xue2， ZHANG Qiaohui2， CHEN Yafei2， BAI Xue1， MA Ru1，

WANG Shuyan2， LIU Zhenquan1*

（1. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 102488， China;

2. School of Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Compound DangguiInjection in the inflammatory reaction of cerebral ischemia stroke based on IL-6 and JAK2/STAT3 signaling pathway. Methods Rats were randomly divided into a blank controlgroup， a sham operation group and a modeling group. Models of rat with cerebral ischemia stroke were reproduced by middle cerebral artery occlusion （MCAO）. After successful modeling， the rats were randomly divided into a model group， a Compound Danggui Injection group and an edaravone group. The rats in each group were given corresponding drugs for 7 days of intervention. Brain tissues were sacrificed 24 hours after the last administration， and TTC staining was used to observe the cerebral infarction of each group of rats; HE staining was used to observe the brain histopathology of various groups of rats; The content of IL-6 in the plasma of rats in each group was detected by ELISA. Western Blot was used to detect the expression of p-JAK2， JAK2， p-STAT3 and STAT3 in the brain tissues of rats in each group. Results The Compound Danggui Injection group can reduce the cerebral infarction area of rats with ischemic stroke and reduce the abnormal morphological changes of neurons in the brain tissue; the content of IL-6 and p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3 level in the Compound Danggui Injection group was lower than in the model group （P<0.01）. Conclusion Compound Danggui Injection can reduce the expression of IL-6， p-JAK2/JAK2， p-STAT3/STAT3 in rats with ischemic stroke， inhibit the inflammatory response， and play a neuroprotective role.

〔Keywords〕 cerebral ischemic stroke; Compound Danggui Injection; inflammatory reaction; IL-6; JAK2/STAT3 signaling pathway

缺血性卒中現已成為世界第三大死亡原因[1]，病死率約為5%～15%，致殘率高達50%[2]。它不僅嚴重威脅患者的生命，而且降低了患者的生活質量，其中主要類型是腦梗死。我國目前的發展趨勢，中醫藥在缺血性卒中的治療中發揮了強大的優勢，不僅可以提高患者的生存率，還可以提高患者術后恢復期和后遺癥期的生活質量。復方當歸注射液（compound angelica injection，CAI）由當歸、川芎與紅花三味中藥組成，臨床用于治療痛經、閉經、風濕痹痛及中風后遺癥等，前期的實驗研究發現CAI對缺血性腦損傷大鼠模型具有發揮神經保護作用[3]。缺血性卒中是指由于血管栓塞或血壓突然下降而引起腦組織某個特定區域缺血，最終導致部分腦組織壞死，神經功能損傷的疾病。越來越多的證據表明，炎性反應在缺血性卒中發生發展中扮演重要角色[4-6]。本實驗研究的IL-6是具有代表性的炎性細胞因子，JAK2/STAT3 是一條重要的炎性反應信號通路，且IL-6以及JAK2/STAT3信號通路相關蛋白（p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3）在血清和腦組織中可表達。本實驗通過IL-6、JAK2/STAT3信號通路在缺血性卒中大鼠模型中的作用，探討復方當歸注射液在缺血性卒中炎性反應中的作用，進一步補充其神經保護機制，為缺血性卒中的臨床用藥提供進一步的科學依據。

1 材料與方法

1.1? 動物

健康雄性SD大鼠90只，購自維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（北京） 2012-0001，等級為SPF級，鼠齡6～8周，體質量（200±20）g，飼養于北京中醫藥大學良鄉校區實驗中心，控制室溫在18～20 ℃，控制濕度在55%～60%，大鼠自由進食飲水，定期更換墊料。

1.2? 主要藥物、試劑與儀器

復方當歸注射液（福建古田藥業有限公司，批號：1710102）;依達拉奉注射液（南京先聲東元制藥有限公司，批號：80-181203）;2，3，5-苯氯化四氮唑（TTC）溶液（美國 Sigma 公司，貨號：T8877-5G）;IL-6 ELISA kit（武漢六合生物技術有限公司，貨號：LH-E10103RA）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司，貨號：P1151-1）;5×蛋白上樣緩沖液（北京普利萊基因技術有限公司，貨號：D8418）;4×SDS-PAGE分離膠緩沖液、4×SDS-PAGE濃縮膠緩沖液、10×TBST緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：S1051、S1052、T1081）;APS、TEMED（美國Amersco公司，貨號：0486、0761）;一抗稀釋液（碧云天生物科技公司，貨號：P0023A）;高靈敏度化學發光檢測試劑盒（ECL）發光液（美國Millipore公司，貨號：WBKLS0100）;兔抗大鼠單克隆p-JAK2抗體、兔抗大鼠單克隆JAK2抗體、兔抗大鼠單克隆p-STAT3抗體、兔抗大鼠單克隆STAT3抗體（均為Cell Signaling Technology產品）;β-Actin小鼠抗大鼠抗體（貨號：TA-09）、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（貨號：ZB-2305）、辣根酶標記山羊抗兔IgG（貨號：ZB-2301）均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。臺式冷凍離心機（德國Eppendrof公司，型號：5424 R）;病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：HistoCore Arcadia C）;iMark酶標儀、PowerPac通用型電泳儀電源均為美國Bio-Rad公司產品;水平電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司，型號：JY-SPAT）;超靈敏多功能成像儀（美國Azure Biosystems公司，型號：C600）;MCAO栓線（北京西濃科技有限公司，貨號：2636-A3）。

1.3? 造模

制備大鼠局灶性腦缺血模型：用10%水合氯醛按照0.04 mL/kg體質量進行麻醉，將大鼠仰臥固定于鼠板上，從頸部正中切開，逐層分離組織，暴露右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA），首先用縫合線結扎CCA近心端和ECA根部、暫時結扎CCA的遠心端，同時用動脈夾暫時夾閉ICA。然后用注射器在CCA結扎處遠心端切入小斜口，接著將直徑為0.25 mm的線栓（光滑球面的一端）經此斜口插入，經CCA分叉處進入ICA，從而閉塞大腦中動脈（MCA）的起始部，線栓平均插入深度為（18.0±0.5）mm，最終造成MCA供血相關區的梗死。假手術組，過程同模型組，分離出右側CCA及ECA、ICA，但僅結扎ECA。

1.4? 分組與干預

實驗動物進行7 d適應性喂養后，按照隨機數字表分為空白對照組、假手術組和造模組，造模成功后，造模組再隨機分為模型組、復方當歸注射液組、依達拉奉組，每組16只。造模1 d后，進行腹腔注射進行給藥，復方當歸注射液組給予0.05 mL/kgCAI，依達拉奉組給予0.03 mL/kg依達拉奉，空白對照組、假手術組和模型組給予0.03 mL/kg生理鹽水。每日1次，連續7 d。

1.5? TTC染色法觀察腦梗死情況

各組大鼠于末次給藥24 h后，每組隨機抽取3只，用10%水合氯醛按照0.04 mL/kg體質量進行麻醉處死，在冰盒上迅速取出全腦，放入-20 ℃冷凍15 min，用刀片將大鼠全腦沿冠狀面切成厚度均勻5片，每片大約2 mm，將腦切片逐一放入在孔板中，每片腦切片滴入等量的1%TTC溶液，在室溫避光環境下染色30 min（15 min時將腦切片翻轉一下）。染色后置于4%多聚甲醛溶液中固定，24 h后對每片腦切片進行拍照記錄。

1.6? HE染色法觀察腦組織病理形態

各組大鼠于末次給藥24 h后，每組隨機抽取3只，用10%水合氯醛按照0.04 mL/kg體質量進行麻醉處死，在冰盒上迅速取出全腦，立即放入10%的甲醛溶液中固定，48 h后，進行石蠟包埋，制備厚度約為5 μm石蠟切片，進行常規HE染色。將切片在400倍光學顯微鏡下進行觀察腦組織結構、神經元數量、細胞核形態和胞質染色情況，拍照記錄。

1.7? ELISA法檢測血漿中IL-6的含量

各組大鼠于末次給藥物24 h后，每組隨機抽取4只，用10%水合氯醛按照0.04 mL/kg體質量進行麻醉，腹主動脈取血，置于采血管中，靜止20 min中，3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清，放入-80 ℃冰箱中備用。嚴格按照IL-6 ELISA kit說明書操作，用酶標儀測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算血漿中IL-6的含量。

1.8? Western Blot法檢測腦組織中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達水平

上述每組4只動物腹主動脈取血后處死，在冰盒上迅速取出全腦，分離出左側（病灶區）半球皮質區，放入-80 ℃冰箱中備用。取40～60 mg腦組織，提取總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，然后進行電泳、電轉，用1×TBST配制的5%脫脂奶粉進行封閉1 h，加入一抗（p-STAT3 1∶4 000，STAT3 1∶2 000，p-JAK2 1∶2 000，JAK2 1∶2 000，β-Actin 1∶10 000），4 ℃孵育過夜，加入用1×TBST配制的5%脫脂奶粉配置的二抗（山羊抗兔IgG-HRP 1∶2 000，山羊抗小鼠IgG-HRP 1∶2 000），室溫搖床孵育1 h，加入ECL 發光液曝光成像，觀察p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達的灰度值，以β-Actin作為內參，用Image J軟件分析灰度值，計算灰度系數比。

1.9? 統計學處理

計量資料用“x±s”表示，各組數據若滿足正態分布和方差齊時，組間比較采用方差分析，方差不齊則用秩和檢驗，同組比較采用成組t檢驗。運用用SAS 9.2和GraphPad Prism8軟件處理。以P<0.05作為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 復方當歸注射液對缺血性卒中大鼠腦梗死面積的影響

TTC染色白色部分為梗死區，粉紅色部分為正常腦組織區。結果表明，空白對照組和假手術組的大鼠未見缺血梗死灶，模型組、復方當歸注射液組、依達拉奉組的大鼠造模后均出現了不同程度的白色梗死灶。與模型組相比，復方當歸注射液組和依達拉奉組的腦梗死面積呈減小趨勢，見圖1。

2.2? 復方當歸注射液對缺血性卒中大鼠腦組織病理狀態的影響

HE染色結果顯示，空白對照組和假手術組腦組織的神經細胞排列密集并整齊，結構形態完整，細胞質豐富，細胞核呈圓形，同時染色清晰;模型組的腦組織神經細胞排列稀疏且紊亂，細胞數量明顯減少，結構松散模糊，并周圍出現不同程度的水腫，細胞質出現大量空泡，細胞核結構出現嚴重皺縮，呈三角形，表明部分細胞已經變形和壞死;與模型組相比，復方當歸注射液組和依達拉奉組的神經細胞結構改變減輕，并且壞死和凋亡的細胞數量減少，見圖2。

2.3? 復方當歸注射液組對缺血性卒中大鼠血漿中IL-6含量的影響

結果顯示，與空白對照組和假手術組比較，模型組中IL-6含量明顯增多（P<0.01）;與模型組相比，復方當歸注射液組和依達拉奉組IL-6含量均明顯減少（P<0.01），見表1。

2.4? 復方當歸注射液對缺血性卒中大鼠腦組織JAK2/STAT3通路相關蛋白表達水平的影響

結果所示，各組JAK2、STAT3蛋白表達均無明顯變化，而模型組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平較假手術組明顯升高（P<0.01）;復方當歸注射液組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平較模型組明顯降低（P<0.01），依達拉奉組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平較模型組也明顯降低（P<0.01）。見圖3和表2。為了更加說明復方當歸注射液對缺血性卒中大鼠腦組織JAK2/STAT3信號的影響，本文對各組p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3水平數據進行分析（n=4），與假手術組比較，模型組p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，復方當歸注射液組和依達拉奉組p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3水平均顯著降低（P<0.01），結果表明，復方當歸注射液可以抑制缺血性卒中大鼠模型JAK2/STAT3信號通路的異常激活。見圖4。

3 討論

缺血性卒中是一個復雜的病理生理過程，其損傷機制主要通過級聯反應發揮，主要包括氧化應激損傷、興奮性氨基酸、鈣超載、酸中毒、炎癥反應和細胞凋亡等。目前，越來越多的證據表明炎癥反應是影響缺血性腦卒中發生發展的重要因素。主要反應包括外周白細胞滲入腦實質和內源性小膠質細胞的激活[7-8]，其主要以炎性級聯反應為主攻擊因素[9-10]，活化促炎細胞因子[11]、趨化因子[12]和黏附分子[13]進而發揮炎性損傷。因此，本文通過線栓法建立缺血性腦卒中大鼠模型，探討復方當歸注射液在缺血性卒中炎性反應中作用，結果顯示，缺血性卒中大鼠模型腦組織出現明顯的梗死灶區域以及神經元損傷、凋亡等病理狀態，同時血漿中IL-6含量顯著增多，腦組織中p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3水平明顯增加;復方當歸注射液干預治療7 d后，大鼠腦組織梗死灶面積減小、細胞凋亡數目明顯減少，同時血漿中IL-6含量顯著減少，腦組織中p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3水平明顯降低。結果表明，復方當歸注射液可以減輕缺血性卒中大鼠模型的炎性反應，發揮神經保護作用。

IL-6是炎性級聯反應中的關鍵因子，屬于多效性的細胞因子，其主要通過浸潤內皮細胞，誘導細胞黏附分子、P-selectin及E-selectin的表達，致使白細胞大量聚集、黏附，從而參與炎性級聯反應，加劇腦損傷[14]。曲穎等[15]研究發現，腦毒清顆粒可以通過降低大鼠腦缺血再灌注損傷后血漿中IL-6的含量，減少腦梗死體積，發揮神經保護作用。因此，目前的研究普遍認為IL-6在缺血性卒中的發生和發展中起著重要作用。抑制其表達可減少炎癥反應，發揮神經功能。

在JAK/STAT信號通路中，JAK2/STAT3信號通路是最重要的一條信號通路。JAK/STAT信號通路主要由三部分組成，即酪氨酸激酶（JAK）家族、酪氨酸激酶相關受體、信號轉導子和轉錄激活子（STAT）家族組成。在JAK/STAT信號通路的傳導過程中，受體首先在細胞膜上與多種細胞因子進行特異性結合，形成二聚體;然后在細胞膜內與JAKs構成結合位點，發生磷酸化，活化的JAKs進一步結合胞漿內STATs，發生磷酸化;接著磷酸化的STATs進入細胞核內，與DNA上的特定基因序列結合，調節轉錄，進而參與細胞生殖、凋亡、應激、炎性反應、免疫調節等多種生理及病理過程[16]。研究表明，JAK2/STAT3信號通路是參與缺血性卒中發生發展的一條重要的炎性反應相關通路[17]，其是參與小膠質細胞活化調節的關鍵，抑制其異常激活，可以減輕小膠質細胞的活化，抑制炎性因子的釋放，減輕炎性損傷，發揮神經保護作用[18]。正常狀態下，p-JAK2 和 p-STAT3 在大鼠腦組織中少量表達，而發生缺血性卒中時其表達量則顯著增加[19]。陳媛等[20]研究發現，葛根素可以通過降低腦缺血再灌注大鼠模型腦組織中p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達水平，減小腦梗死面積，發揮神經保護作用。因此，通過抑制JAK2/STAT3信號通路的異常激活，可以減輕缺血性卒中大鼠的炎性反應，發揮神經保護作用。

綜上所述，復方當歸注射液可以減輕缺血性卒中大鼠模型的炎性反應，減小腦梗死面積，提高神經元的存活數量，發揮神經保護作用，其發揮保護作用的機制可能與抑制炎性因子IL-6表達以及JAK2/STAT3信號通路的異常激活相關，在后續的實驗中需要對其機制進行更深入的研究。

參考文獻

[1] MERCHAN-BAEZA J A， GONZALEZ-SANCHEZ M， CUESTA-VAEGAS A. Clinical Effect Size of an Educational Intervention in the Home and Compliance With Mobile Phone-Based Reminders for People Who Suffer From Stroke： Protocol of a Randomized Controlled Trial[J]. JMIR Research Protocols， 2015，4（1）：e33（1-11）.

[2] 劉紅艷.益氣活血祛瘀法對缺血性卒中患者神經功能的影響[J].光明中醫，2018，33（2）：165-167.

[3] 湯軼波，朱春燕，袁偉暢，等.復方當歸注射液對大鼠缺血性腦損傷模型的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2015，22（2）：68-70.

[4] DZIEDZIC T. Systemic inflammation as a therapeutic target in acute ischemic stroke[J]. Expert Review of Neurotherapeutics， 2015，15（5）：523-531.

[5] GU Y， CHEN J， SHEN J. Herbal medicines for ischemic stroke： combating inflammation as therapeutic targets[J]. Journal of Neuroimmune Pharmacol， 2014，9（3）：313-339.

[6] JIN R， LIU L， ZHANG S， et al. Role of inflammation and its mediators in acute ischemic stroke[J]. Journal of Cardiovascular Translational Research， 2013，6（5）：834-851.

[7] SAMSON Y， LAPERGUE B， HOSSEINI H. Inflammation and ischaemic stroke： current status and future perspectives[J]. Nature Reviews Neurology （Paris）， 2005，161（12 pt 1）：1177-1182.

[8] CHAMORRO A， HALLENBECK J. The harms and benefits of inflammatory and immune responses in vascular disease[J]. Stroke，2006，37（2）：291-293.

[9] DANTON G H， DIETRICH W D. Inflammatory mechanisms after ischemia and stroke[J]. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology， 2003，62（2）：127-136.

[10] BESCHORNER R， SCHLUESENER H J， GOZALAN F， et al. Infiltrating CD14+ monocytes and expression of CD14 by activated parenchymal microglia/macrophages contribute to the pool of CD14+ cells in ischemic brain lesions[J]. Journal of Neuroimmunol， 2002，126（1-2）： 107-115.

[11] HAN H S， YENARI M A. Cellular targets of brain inflammation in stroke[J]. Curr Opin Investig Drugs， 2003，4（5）：522-529.

[12] GARAU A， BERTINI R， COLOTTA F， et al. Neuroprotection with the CXCL8 inhibitor repertaxin in transient brain ischemia[J]. Cytokine， 2005，30（3）：125-131.

[13] SUDHRUE M E， MEHRA A， CONNOLLY E S， et al. Anti-adhesion molecule strategies as potential neuroprotective agents in cerebral ischemia： a critical review of the literature[J]. Inflammation Research， 2004，53（10）：497-508.

[14] WYTRYKOWSK A， PROSBA-MACKIEWICZ M， NYKAWM. IL-1β， TNF-α， and IL-6 levels in gingival fluid and serum of patients with ischemic stroke[J]. Journal of Oral Science， 2016;58（4）：509-513.

[15] 曲? 穎，王? 巍，賈維剛，等.腦毒清顆粒對大鼠腦缺血再灌注損傷后IL-6和TNF-α含量的影響[J].中國中醫急癥，2014，23（10）：1823-1825.

[16] RAIBLE D J， FREY L C， BROOKS-KAYAL A R. Effects of JAK2-STAT3 signaling after cerebral insults[J]. JAK-STAT，2014，3（2）：e29510.

[17] WANG X L， QIAO C M， LIU J O， et al. Inhibition of the SOCS1-JAK2-STAT3 Signaling Pathway Confers Neuroprotection in Rats with Ischemic Stroke[J]. Cellular Physiology and Biochemistry， 2017， 44（1）：85-98.

[18] 張 賀.二氫楊梅素通過抑制小膠質細胞中NF-κB和JAK2/STAT3信號通路來減輕脂多糖誘導的炎癥反應[D].南京：南京大學，2017.

[19] ZHANG Y， LIU J， YANG B， et al. Ginkgo biloba Extract Inhibits Astrocytic Lipocalin-2 Expression and Alleviates Neuroinflammatory Injury via the JAK2/STAT3 Pathway After Ischemic Brain Stroke[J]. Frontiers in Pharmacology， 2018，4（16）：518-524.

[20] 陳? 媛，黃曉松，吳海金，等.葛根素對大鼠腦缺血再灌注損傷后JAK2/STAT3信號通路的影響[J].湖南中醫雜志，2017，33（4）：144-147，165.

〔收稿日期〕2019-11-06

〔基金項目〕國家自然科學基金項目（81603453）。

〔作者簡介〕李? 月，女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥藥理腦病防治。

〔通訊作者〕*劉振權，男，教授，博士研究生導師，E-mail：lzqbzy@sina.com。