基于網絡藥理學的桂枝甘草湯抗失眠作用的潛在機制研究

黃強　汪亞楠　韓飛　劉明

〔摘要〕 目的 利用網絡藥理學技術對桂枝甘草湯抗失眠的潛在作用機制進行探討研究。方法 首先，利用TCMSP、Swiss、SuperPred和Stitch數據庫尋找與桂枝甘草湯方中2味中藥材有關的化學成分及其可能的作用靶點，并設定OB≥30%、DL≥0.18為閾值對化學成分進行篩選，再利用文獻檢索加以補充;同時，通過OMIM、TTD、Gene Card、 Pharm Gkb等數據庫獲取與失眠癥相關的靶標，并進一步建立桂枝甘草湯抗失眠作用的靶點;然后，利用DAVID數據庫對失眠癥相關的作用靶點進行GO及KEGG富集分析;最后，采用Cytoscape軟件構建“單味藥-活性成分-作用靶點”相互作用網絡并進行度值和介數值分析，確認關鍵靶點和關鍵通路。結果 在桂枝甘草湯中，共篩選出101個與失眠相關的潛在活性成分，主要涉及MAPT、ESR1、CYP19A1等85個潛在作用靶點;GO 生物功能分析共包含293條富集結果，主要涉及蛋白結合、質膜等;KEGG富集分析得到18條代謝通路，主要包括神經活性配體-受體相互作用通路、鈣信號通路、5-羥色胺能突觸通路等。結論 本研究揭示了桂枝甘草湯治療失眠癥的“多成分-多靶點-多途徑”的作用特點，并預測了其可能的活性成分、關鍵靶點和作用通路，為其藥效物質基礎和作用機制研究提供了理論基礎。

〔關鍵詞〕 失眠;桂枝甘草湯;網絡藥理學;靶點;作用機制

〔中圖分類號〕R256.23? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.04.013

Potential Mechanism of Anti-insomnia Effect of Guizhi Gancao Decoction Based on

Network Pharmacology

HUANG Qiang1， WANG Yanan2， HAN Fei2， LIU Ming1*

（1. Patent Examination Cooperation Jiangsu Center of the Patent Office， State Intellectual Property Office， Suzhou， Jiangsu 215163， China; 2. Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang， Liaoning 110016， China）

〔Abstract〕 Objective To study the potential mechanism of the anti-insomnia effect of Guizhi Gancao Decoction （GGD） by using network pharmacological technology. Methods Firstly， TCMSP， Swiss， SuperPred and Stitch databases were used to search for the chemical compounds and the possible targets related to the 2 herbs in GGD. OB ≥ 30%， DL ≥ 0.18 were set as screening conditions to screen for chemical compounds. Literatures were searched for supplement. Meanwhile， the targets related to insomnia were screened through OMIM， TTD， Gene Card and Pharm Gkb databases. Moreover， the interactive targets of GGD and insomnia were further constructed. Then， GO analysis and KEGG enrichment analysis of insomnia related targets were performed using DAVID database. Finally， degree and betweenness analysis were performed to find key targets and key pathways after the “single herb-active compounds-acting targets” interaction network was constructed by Cytoscape software. Results A total of 101 potential active compounds related to insomnia were screened in GGD， which mainly involved 85 potential targets such as MAPT， ESR1 and CYP19A1. A total of 293 enrichment results were obtained by GO analysis， mainly involving protein binding， plasma membrane， etc. 18 metabolic pathways were obtained through KEGG analysis， mainly including neuroactive ligand-receptor interaction pathway， calcium signaling pathway， serotonergic synapse and etc. Conclusion This study revealed the action characteristics of GGD with “multi-compounds， multi-targets and multi-pathways” in the treatment of insomnia and predicted its possible active ingredients， key targets and action pathways， which provided a theoretical basis for the study of its pharmacodynamic material basis and action mechanism.

〔Keywords〕? insomnia; Guizhi Gancao Decoction; network pharmacology; targets; action mechanism

失眠通常是指患者對睡眠時間和（或）質量不滿足而影響日間社會功能的一種主觀體驗，臨床表現為入睡困難、睡眠維持障礙、早醒、睡眠質量下降、總睡眠時間減少并同時伴有日間功能障礙等[1-2]。近年來，隨著經濟的發展，人們的生活壓力越來越大，我國失眠群體正趨于年輕化。2018年中國睡眠研究會數據顯示，我國超過60%的重度失眠患者為90后[3]。而且已有多項研究表明，失眠往往與人體多個系統的生理功能紊亂和多種疾病的發生發展具有密切的關系[4-5]。然而，失眠的形成原因多樣、發生機制復雜、臨床研究尚不充分，針對其治療的藥物也多以鎮靜催眠類西藥為主，且這些藥物普遍具有成癮性，患者長期服用易產生藥物依賴性，在治療過程中往往難以取得理想的療效[6-7]。因此，研究開發可有效防治失眠且毒副作用小的藥物具有重大意義。

傳統中醫認為人的睡眠是營衛之氣正常循行，陰陽之氣規律轉化的結果，當這種規律性遭到破壞時，人體就會出現睡眠障礙，而中醫藥可通過辨證論治補其不足，瀉其有余，調其虛實，使氣血調和，陰陽平衡，從根本上對機體進行調節達到痊愈的目的[8]。而且，中醫藥治療失眠既不會產生成癮性、依賴性和耐藥性，且不良反應少，毒副作用小，故用中醫藥辨證治療失眠具有很大的優勢。中藥桂枝甘草湯出自漢代張仲景名著《傷寒論》，是由桂枝和甘草兩味中藥組成，具有溫補心陽、生陽化氣之功效，是治療心陽虛之祖方[9]。近期，我們通過研究桂枝甘草湯對腹腔注射氯苯丙氨酸所致失眠模型大鼠的影響發現，桂枝甘草湯可通過調控大鼠血漿和腦組織內神經遞質5-HT、NE、DA的平衡而達到抗失眠的藥理作用。由此可見，桂枝甘草湯具有潛在的抗失眠作用。

英國藥理學家Hopkins[10]于2007年在系統生物學與多向藥理學的基礎上首次提出了網絡藥理學的概念。該技術是利用生物分子網絡分析方法，通過網絡中節點的連接和節點之間的相互作用關系來分析網絡的特征，從多維度視角探索藥物干預疾病的分子機制，特別適用于多成分、多靶點、多途徑的中藥藥效物質基礎和作用機制的研究[11-13]。因此，本研究嘗試采用網絡藥理學的方法和思維，通過構建“單味藥-活性成分-作用靶點”網絡模型系統地預測桂枝甘草湯抗失眠癥“多成分-多靶點-多途徑”的作用特點，以期為進一步研究其抗失眠的藥效物質和作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1? 軟件與數據庫

TCMSP數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/）;ChemBioDraw軟件;Swiss數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）;SuperPred數據庫（http：//prediction.charite.de/）;Stitch數據庫（http：//stitch.embl.de/）;? ? ?String數據庫（https：//string-db.org/）;OMIM數據庫（http：//www.omim.org/）;TTD數據庫（http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/）;PharmGkb數據庫（https：//www.pharmgkb.org/）;Gene Card數據庫（https：//www.genecards.org/）;Uniprot數 據 庫（http：//www.unipr？鄄ot.org/）;DAVID 6.8數據庫（https：//david. ncifcrf.gov/）;Cytoscape軟件（Version 3.4.0）;OriginPro軟件（Version 8.0）;Omicshare平臺（http：//www.omicshare.com/tools/index.php/）。

1.2? 方法

1.2.1? 桂枝甘草湯化學成分信息的歸納和整理? 利用TCMSP數據庫并結合文獻檢索收集與桂枝甘草湯中的2味藥材相關的化學成分信息并保存其化學結構，然后采用ChemBioDraw軟件得到化學成分結構的Smiles格式。

1.2.2? 活性成分的篩選? 收集的化學成分中，以同時滿足OB≥30%、DL≥0.18為條件進行化合物篩選，得到桂枝甘草湯的潛在活性成分。同時，通過結合文獻挖掘和整理，對篩選結果進行補充，盡可能全面地獲得桂枝甘草湯的主要活性成分。

1.2.3? 靶點的預測? 在Swiss、SuperPred、Stitch數據庫中上傳桂枝甘草湯潛在活性成分的Smiles結構進行靶點預測，將所得靶點去重后即得活性成分相關靶點信息。以“insomnia”為關鍵詞在OMIM、TTD、Gene Card、PharmGkb數據庫中進行檢索獲取相關靶點信息，將得到的靶點利用Uniprot矯正并去除假陽性基因，合并去重后即得疾病相關靶點信息。最后，將活性成分相關靶點與疾病靶點進行對比分析，得交互靶標，即桂枝甘草湯抗失眠的潛在作用靶點。

1.2.4? 靶點相互作用網絡構建? 通過String數據庫獲得交互靶標的靶點相互作用關系，并保存為TSV格式[14]。然后，將該文件中的node1、node2和combined score信息導入到Cytoscape軟件中，構建靶點相互作用網絡。

1.2.5? 網絡構建? 利用Cytoscape 3.4.0軟件對“1.2.4”數據進行可視化處理，即構建桂枝甘草湯抗失眠的“單味藥-活性成分-作用靶點”網絡模型，再利用度值、介數值等參數對上述模型進行分析。節點的度值和介數值越大，在網絡中的重要性就越強[15]。

1.2.6? GO生物功能富集分析? 將上述潛在作用靶點輸入到DAVID 6.8數據庫中，獲得GO生物功能富集分析，然后限定P<0.05，使用OriginPro軟件將結果繪制條形圖展示。

1.2.7? KEGG代謝通路富集分析? 利用DAVID 6.8數據庫對潛在作用靶點進行KEGG代謝通路富集分析。將基因物種和背景限定為人，并設定P<0.05，得富集結果，再通過Omicshare平臺進行可視化處理。

2 結果

2.1? 桂枝甘草湯潛在活性成分篩選

通過TCMSP數據庫收集桂枝甘草湯中2味藥材的化合物，再根據OB和DL值共篩選得到99個成分，但因甘草中glycyroside與疾病靶點無關聯性而被剔除。因此，共得到98個潛在活性成分，其中甘草中包含91個，桂枝中包含7個。另外，通過文獻挖掘和整理發現，在桂枝和甘草中仍可能含有一些其它的活性成分，因其不滿足OB、DL值而被刪除。比如，桂枝中桂皮醛具有降壓、降糖、抗炎、抗抑郁、神經保護等藥理作用[16];甘草中甘草甜素可能通過調控cyclin D1和P21蛋白表達以及PI3K/AKT信號通路激活來抑制前列腺癌細胞株PC3的生長[17];而18β-甘草次酸可通過抑制炎癥反應及氧化應激，從而減輕腦組織細胞凋亡及腦損傷[18]。故將上述3個活性成分納入，最終獲得101個潛在活性成分，其基本信息見表1。

2.2? 桂枝甘草湯抗失眠的靶點預測

通過Swiss、SuperPred、Stitch數據庫對101個潛在活性成分進行靶點預測，得甘草潛在作用靶點452個、桂枝201個;將靶點進行合并去重得活性成分相關靶點491個。然后，利用OMIM、TTD、GAD、PharmGkb數據庫以“insomnia”為關鍵詞進行檢索，篩選得疾病相關靶點668個。最后，將潛在活性成分靶點與疾病靶點進行對比匹配，最終獲得與桂枝甘草湯抗失眠癥相關的潛在作用靶點85個。

2.3? 靶點相互作用網絡分析

利用String數據庫獲得85個潛在作用靶點的相互作用關系。該網絡中包含84個節點和567條邊，平均局部聚類系數為0.557，平均節點度值為13.3。（SLC28A2因與其它靶點沒有相聯性而未體現在該網絡中）從圖1可以直觀的看出，度值較大的靶點是ALB、BDNF、SLC6A4、HTR3A、ACHE，分別為48、40、27、27、27，說明這些靶點在整個網絡中發揮重要作用。提示這些靶點可能是桂枝甘草湯治療失眠癥的關鍵靶點。

2.4? 桂枝甘草湯單味藥-活性成分-作用靶點相互作用網絡分析

利用Cytoscape軟件構建桂枝甘草湯中2味藥材、101個潛在活性成分、85個潛在作用靶點的“單味藥-活性成分-作用靶點”相互作用網絡（圖2）。在該網絡中，共包含188個節點和616條邊。表1中列出了101個潛在活性成分的度值。據表1可知，化合物cinnamaldehyde（桂皮醛）度值最大，與40個靶點相連，介數值為0.105 8;其次是glycyrrhizin（甘草甜素），與38個靶點相連，介數值為0.122 6;然后是quercetin（槲皮素），與37個靶點相連，介數值為0.160 3。這些擁有較高度值和介數值的潛在活性成分可能在桂枝甘草湯抗失眠的功效中發揮著重要的作用。此外，靶點MAPT、ESR1、CYP19A1也擁有較高的度值（79、42、39）和介數值（0.239 3、0.064 8、0.034 3）。由此推斷，這些靶點可能與桂枝甘草湯抗失眠的藥理作用密切相關。對網絡進行系統分析可知，整個網絡的平均度值為6.54，其中每個化合物平均與6.09個靶點相互作用，每個靶點平均與6.05個化合物相互作用，說明在桂枝甘草湯中存在著不同活性成分作用于不同靶點或作用于同一靶點的現象，充分體現出桂枝甘草湯以“多成分、多靶點”協同治療失眠癥的作用機制。

2.5? GO生物功能富集分析

采用DAVID 6.8數據庫對85個潛在作用靶點進行GO基因本體富集分析，確定了293個GO條目。其中，相關條目最多的是生物學過程（BP）211個，主要涉及氧化還原過程、信號轉導、G蛋白偶聯受體信號通路等;其次是分子功能（MF）相關條目53個，主要涉及蛋白結合、酶結合、氧化還原酶活性等;最后是細胞組成（CC）相關條目29個，主要涉及質膜、膜的組成、內質網等;然后限定P<0.05，利用OriginPro8.0繪制條形圖展示前20條富集結果（圖3）。顯然，與桂枝甘草湯抗失眠相關的關鍵靶標主要與氧化還原過程、蛋白結合、質膜等生物功能有關。

2.6? KEGG代謝通路富集分析

利用DAVID 6.8數據庫對85個潛在作用靶點進行KEGG代謝通路富集分析，限定P<0.05，共獲得18條KEGG代謝通路及其相關信息，再通過Omicshare平臺對富集分析結果進行可視化處理，得氣泡圖（圖4）。從圖中可以看出，涉及基因數較多的代謝通路主要包括：神經活性配體-受體相互作用通路（neuroactive ligand-receptor interaction）、鈣信號通路（calcium signaling pathway）、5-羥色胺能突觸通路（serotonergic synapse）、cAMP信號通路（cAMP signaling pathway）等。以上數據表明，桂枝甘草湯的潛在活性成分可能主要通過作用于上述代謝通路發揮治療失眠癥的療效。

3 討論

本研究采用網絡藥理學研究策略，構建了桂枝甘草湯“單味藥-活性成分-作用靶點”交互網絡模型，最終共篩選出101個潛在活性成分，85個作用靶點，18條與失眠癥相關的KEGG代謝通路，基本闡明了桂枝甘草湯治療失眠癥的“多成分-多靶點-多通路”的可能作用機制。

從桂枝甘草湯“單味藥-活性成分-作用靶點”相互作用網絡中分析可知，桂皮醛是與失眠癥相關靶點作用最多的化學成分。鄭芳昊等[19]采用行為藥理學實驗方法，通過高架十字迷宮和曠場實驗證明了桂皮醛可使大鼠睡眠潛伏期縮短，睡眠持續時間增加。肖剛等[20]通過研究甘草甜素對大鼠蛛網膜下腔出血后血腦屏障損傷的影響發現，甘草甜素可降低腦組織中的IL-6細胞因子。而IL-6是一種與睡眠/剝奪關系密切的細胞因子，IL-6能夠抑制IL-1的合成，降低IL-6細胞因子，則IL-1合成增多，進而增強患者非快眼動睡眠的時間[21]?？梢?，以上化學成分極有可能是桂枝甘草湯抗失眠的藥效物質。

靶點分析結果表明，靶點MAPT其度值最大，可能是重要的關鍵靶點。相關研究[22-23]表明，MAPT基因主要負責編碼神經元微管相關蛋白tau，當MAPT基因突變時則會加劇tau蛋白的聚集，引起神經元細胞功能障礙和神經元數目減少，導致γ-氨基丁酸（GABA）、多巴胺（DA）等神經遞質釋放異常，進而引發睡眠障礙。因此，靶點MAPT可能是桂枝甘草湯治療失眠癥的關鍵作用靶點。靶點ESR1也在“單味藥-活性成分-作用靶點”相互作用網絡中顯示出突出的地位。Helen等[24]認為雌激素可以通過作用于表達ER的GABA能中間神經元，促進鄰近神經元腦源性神經營養因子（brain derived neur？鄄otrophic factor，BDNF）的表達，或者通過與位于BDNF基因上的雌激素反應元件相互作用，誘導BDNF的表達。同時，已有多項臨床研究表明BDNF的神經營養功能參與了睡眠的自我平衡調節過程[25]。

KEGG代謝通路結果顯示，涉及靶點最多的代謝通路是神經活性配體-受體相互作用通路，該通路包含質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體[26]。A類生物胺類是一種對多種行為有潛在效應的神經遞質，其中包括與失眠癥密切相關的DA、NE、5-HT等神經遞質，當腦內5-HT升高，NE、DA降低時，將有助于失眠癥的治療。其次，在桂枝甘草湯發揮抗失眠的藥理過程中鈣信號通路可能也發揮著重要的作用。眾所周知，神經遞質的釋放離不開鈣離子通道，而N型和P/Q型鈣離子通道則主要存在于神經元內，影響中樞神經系統DA、NE、Glu、GABA等神經遞質的釋放和傳遞，臨床上治療失眠癥的西藥多是GABA復合受體拮抗劑，其作用機制就是通過促進中樞抑制性神經遞質GABA的釋放或突觸的傳遞而發揮抗失眠的藥理作用[27]。所以，桂枝甘草湯可能通過調節上述這些代謝通路而影響中樞神經系統中神經遞質的釋放及突觸傳遞，最終達到良好的治療效果。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法剖析了桂枝甘草湯治療失眠癥的潛在藥效物質和可能的作用機制，構建了“單味藥-活性成分-作用靶點”和靶點相互作用網絡，并進行了生物功能和代謝通路富集分析。結果表明，桂枝甘草湯中的101個潛在活性成分可能主要是通過作用于MAPT、ESR1、CYP19A1等85個與失眠癥相關的潛在作用靶點，富集于蛋白結合、質膜、神經活性配體-受體相互作用通路、鈣信號通路等多種生物功能和代謝通路中，以緩解神經元損傷、調控神經遞質釋放、調節突觸傳遞等多種途徑來增加不同時期的睡眠時間，發揮良好的抗失眠藥理作用。該研究體現出桂枝甘草湯“多成分、多靶點、多途徑”協同治療失眠癥的復雜機制，為后續更精準的研究其藥效物質基礎和作用機制提供了理論基礎。

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〔收稿日期〕2019-08-28

〔作者簡介〕黃? 強，男，副研究員，研究方向：醫藥領域的專利申請審查。

〔通訊作者〕*劉? 明，男，助理研究員，E-mail：liuming_2@cnipa.gov.cn。