半枝蓮新克羅烷型二萜成分逆轉腫瘤多藥耐藥活性研究

李錦梅，李丹丹，嚴 威，陳宣欽，李洪梅，李蓉濤，劉 丹

昆明理工大學生命科學與技術學院，昆明650500

腫瘤細胞接觸抗癌化學藥物后產生的耐藥性，特別是多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)，這被認為是腫瘤治療期間導致化療失敗的重要原因[1]。腫瘤多藥耐藥的機制比較復雜[2]，其中，ATP結合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉運蛋白超家族與多藥耐藥密切相關，以P-糖蛋白(P-gp)過表達引起的藥物外排是產生MDR的主要機制[3]。

半枝蓮(ScutellariabarbataD.Don)為唇形科黃芩屬植物，中醫常以其全草入藥[4]，臨床用于治療癌癥，如人子宮平滑肌瘤、哺乳動物和卵巢癌的抗腫瘤治療等[5]。半枝蓮的藥理研究證實，其提取物在體外和體內是肝癌的有效抑制劑[6]。從半枝蓮中分離得到的葉綠素a的衍生物，可以通過抑制P-糖蛋白的表達，并誘導HepG2的細胞周期阻滯來降低耐藥性[7]。本文從半枝蓮中分離獲得6個新克羅烷型二萜化合物，發現化合物1、2、3、6具有體外逆轉腫瘤多藥耐藥的活性，并對相關機制進行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 提取和分離

半枝蓮干燥全草50 kg粉碎，95%乙醇冷浸提取三次，每次間隔24 h，合并提取液，減壓濃縮直至無乙醇味后用水溶解成混懸液，并用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取3次，減壓濃縮后回收溶劑，分別得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。氯仿萃取物用2 kg硅膠(100～200目)拌樣，10 kg硅膠(200～300目)填柱，用石油醚/丙酮(20∶1、10∶1、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、1∶1)梯度洗脫，應用薄層色譜檢測合并得到8個餾分，即餾分A～H。F餾分(37.5 g)利用MCI脫色素后，反復利用正向柱和反向柱色譜及凝膠柱純化后，通過半制備HPLC的到化合物1(14.1 mg)、2(1.3 mg)、3(10.5 mg)、4(1.8 mg)、5(4.0 mg)和6(2.0 mg)，經NMR核磁數據分析及參考文獻比對，確定化合物結構。

1.2.2 細胞培養

HepG2和HepG2/Adr細胞使用DMEM培養基(10%的胎牛血清和1%的青/鏈霉素雙抗)置于37 ℃、5%的CO2的培養箱中培養，每日觀察細胞生長情況。耐藥細胞添加0.1 μg/mL Adr以維持耐藥性。

1.2.3 抗腫瘤活性測定

將對數生長期的HepG2和HepG2/Adr細胞,以1×104/孔接種于96孔板中培養24 h，化合物1～6(20 μM)處理細胞48 h后，每孔加入20 μL(5 mg/mL)MTT，并于培養箱中孵育4 h，除去MTT和培養基，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床避光搖勻，15分鐘之后使用SpetraMax M2酶標儀，在490 nm下測量吸光值。

1.2.4 逆轉腫瘤多藥耐藥測定

這類城市的人口及土地規模比例基本處于較為適宜的程度，隨著經濟發展程度的提高，有利于提升城市居民的生活品質。所以此類城市，可適當增加城市建成區的面積，方便轉接大城市或特大城市的產業轉移，以中高端產業發展為主。同時，應積極借鑒中外大城市發展的經驗，積極解決已經出現的城市問題。

HepG2/Adr細胞接種到96孔板中，將濃度為0.1、1、10、30、60 μM的Adr分別與20 μM的化合物共同處理48小時。用“1.2.3”中MTT方法檢測細胞活度。其中，逆轉倍數(RF)值：單獨阿霉素的IC50/化合物與阿霉素聯用時的IC50，每個Adr濃度設置3個復孔，維拉帕米(20 μM)作為陽性對照。

1.2.5 細胞內阿霉素積累

將HepG2/Adr細胞以1×104/孔的密度接種在96孔板中，并分成以下組：阿霉素(40 μM)處理組；化合物(20 μM)與阿霉素(40 μM)聯合用藥組；阿霉素(40 μM)與維拉帕米(20 μM)聯合用藥組。給藥后培養箱中孵育6 h，冰預冷的PBS避光洗滌細胞三次，使用倒置熒光顯微鏡觀察阿霉素在細胞內的積累情況，并采用SpetraMax M2酶標儀測量細胞內阿霉素的熒光值，激發波長為480 nm，發射波長為560 nm。

1.2.6 Western blotting分析

HepG2/Adr和HepG2細胞分別以密度3×105個/孔接種于12孔板，培養24 h并進行藥物處理，48 h后收集細胞，裂解收集蛋白，上樣之后，利用聚丙烯酰胺進行電泳(SDS-PAGE)并轉膜(硝酸纖維素膜：NC膜)，脫脂奶粉4 ℃室溫封閉1 h，低溫孵育一抗過夜(一抗按照1∶1 000比例稀釋)，次日，用PBST緩慢蕩洗3次，每次6 min；最后，用PBS洗膜1次，室溫孵育二抗1 h(二抗按照1∶2 000比例稀釋)，加入超敏ECL化學發光試劑(試劑A和試劑B按照 1∶1 的比例)，使用化學發光凝膠成像分析系統進行顯影，并用Image J對蛋白條帶進行灰度分析。

1.3 統計分析

2 結果和分析

2.1 結構鑒定

化合物1白色無定型粉末;C33H35NO7，ESI-MS：m/z557；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：1.36(1H，m，Ha-1)，1.66(1H，m，Hb-1)，2.12(1H，m，Ha-2)，1.96(1H，m，Hb-2)，5.22(1H，br s，H-3)，5.90(1H，d，J=10.1 Hz，H-6)，5.70(1H，d，J=10.1 Hz，H-7)，2.40(1H，br d，J=12.0 Hz，H-10)，6.42(1H，d，J=16.7 Hz，H-11)，6.46(1H，d，J=16.7 Hz，H-12)，5.92(1H，br s，H-14)，5.02(2H，br s，H-16)，1.09(3H，s，H-17)，1.70(3H，s，H-18)，1.39(3H，s，H-19)，1.28(3H，s，H-20)，2.79(H，br s，H-OH)，7.97(2H，dd，J=7.5，1.0 Hz，H-3′′，H-7′′)，7.47(2H，d，J=7.7 Hz，H-4′′，H-6′′)，7.60(1H，d，J=7.5 Hz，H-5′′)，9.14(1H，br s，H-3′′′)，8.68(1H，br d，J=4.8 Hz，H-5′′′)，7.23(1H，dd，J=4.7，7.7 Hz，H-6′′′)，8.07(1H，br d，J=7.7 Hz，H-7′′′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：19.3(CH2，C-1)，26.2(CH2，C-2)，123.(CH，C-3)，140.7(C，C-4)，43.4(C，C-5)，75.8(CH，C-6)，76.2(CH，C-7)，76.9(C，C-8)，48.3(C，C-9)，42.8(CH，C-10)，146.8(CH，C-11)，121.9(CH，C-12)，162.2(C，C-13)，115.0 9(CH，C-140)，174.1(C，C-15)，70.7(CH2，16)，22.5(CH3，C-17)，20.1(CH3，C-18)，17.4(CH3，C-19)，15.4 9(CH3，C-20)，165.1(C，C-1′′)，130.8(C，C-2′′)，129.6(CH，C-3′′，C-7′′)，128.9(CH，C-4′′，C-6′′)，133.8(CH，C-5′′)，164.1(C，C-1′′′)，126.1(C，C-2′′′)，150.8(CH，C-3′′′)，153.5(CH，C-5′′′)，123.3(CH，C-6′′′)，136.2(CH，C-7′′′)。以上波譜數據與文獻[8]對照基本一致，故確定化合物1為scutebarbatine Y。

化合物2白色無定型粉末;C33H35NO7，ESI-MS：m/z557；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：1.35(1H，m，Ha-1)，1.66(1H，m，Hb-1)，2.04(2H，m，H-2)，5.25(1H，br s，H-3)，5.93(1H，d，J=10.8 Hz，H-6)，5.72(1H，d，J=10.8 Hz，H-7)，2.36(1H，br d，J=11.6 Hz，H-10)，6.46(1H，d，J=16.9 Hz，H-11)，6.40(1H，d，J=16.9 Hz，H-12)，5.94(1H，br s，H-14)，5.00(2H，br s，H-16)，1.07(3H，s，H-17)，1.68(3H，s，H-18)，1.41(3H，s，H-19)，1.28(3H，s，H-20)，8.99(1H，br s，H-3′′)8.62(1H，br d，J=4.6 Hz，H-5′′)，7.25(1H，dd，J=4.6，8.0 Hz，H-6′′)，8.15(1H，d，J=8.0 Hz，H-7′′)，8.84(2H，m，H-3′′′，H-7′′′)，7.34(2H，m，H-4′′′，H-6′′′)，7.49(1H，br t，J=7.6 Hz，H-5′′′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：19.8(CH2，C-1)，26.7(CH2，C-2)，123.2(CH，C-3)，140.7(C，C-4)，43.3(C，C-5)，76.2(CH，C-6)，75.5(CH，C-7)，76.2(C，C-8)，48.4(C，C-9)，42.4(CH，C-10)，140.7(CH，C-11)，120.2(CH，C-12)，164.3(C，C-13)，117.7(CH，C-14)，174.6(C，C-15)，73.7(CH2，C-16)，22.6(CH3，C-17)，20.1(CH3，C-18)，17.3(CH3，C-19)，14.1(CH3，C-20)，164.3(C，C-1′′)，126.0(C，C-2′′)，150.7(CH，C-3′′)，153.3(CH，C-5′′)，123.2(CH，C-6′′)，136.7(CH，C-7′′)，164.7(C，C-1′′′)，130.5(C，C-2′′′)，129.7(CH，C-3′′′，C-7′′′)，128.4(CH，C-4′′′，C-6′′′)，133.5(CH，C-5′′′)。以上波譜數據與文獻[9]對照基本一致，故確定化合物2為scutebarbatine B。

化合物3白色無定型粉末;C33H35NO7，ESI-MS：m/z557；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：1.60(1H，m，Ha-1)，1.74(1H，m，Hb-1)，2.08(2H，m，H-2)，5.26(1H，br s，H-3)，5.90(1H，d，J=9.8 Hz，H-6)，5.73(1H，d，J=9.8 Hz，H-7)，2.41(1H，br d，J=12.3 Hz，H-10)，6.19(1H，d，J=17.0 Hz，H-11)，6.25(1H，d，J=17.0 Hz，H-12)，6.06(1H，br s，H-14)，4.80(1H，br d，Ha-16)，4.86(1H，br d，Hb-16)，1.17(3H，s，H-17)，1.58(3H，s，H-18)，1.42(3H，s，H-19)，1.28(3H，s，H-20)，9.20(1H，br s，H-3′′)，8.82(1H，br s，H-5′′)，7.45(1H，d，J=8.0 Hz，H-6′′)，8.26(1H，d，J=8.0 Hz，H-7′′)，7.84(2H，d，J=7.4 Hz，H-3′′′，H-7′′′)，7.35(2H，d，J=7.8 Hz，H-4′′′，H-6′′′)，7.48(1H，d，J=7.4 Hz，H-5′′′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：19.8(CH2，C-1)，26.1(CH2，C-2)，123.1(CH，C-3)，140.7(C，C-4)，43.3(C，C-5)，76.5(CH，C-6)，75.4(CH，C-7)，77.3(C，C-8)，50.8(C，C-9)，42.6(CH，C-10)，143.8(CH，C-11)，120.3(CH，C-12)，164.4(C，C-13)，117.9(CH，C-14)，174.4(C，C-15)，73.9(CH2，C-16)，22.7(CH3，C-17)，20.1(CH3，C-18)，17.5(CH3，C-19)，18.4(CH3，C-20)，165.0(C，C-1′′)，126.1(C，C-2′′)，151.7(CH，C-3′′)，154.3(CH，C-5′′)，123.4(CH，C-6′′)，138.4(CH，C-7′′)，164.8(C，C-1′′′)，128.6(C，C-2′′′)，129.9(CH，C-3′′′，C-7′′′，128.3(CH，C-4′′′，C-6′′′)，133.4(CH，C-5′′′)。以上波譜數據與文獻[10]對照基本一致，故確定化合物3為scutebartine F。

化合物4白色無定型粉末;C25H38O8，ESI-MS：m/z466；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：4.34(1H，dd，J=4.7，11.7 Hz，H-6)，4.38(1H，dd，J=5.6，11.8 Hz，H-11)，2.22(1H，m，H-13)，4.96(1H，d，J=5.6 Hz，H-15)，5.78(1H，d，J=5.3 Hz，H-16)，2.16(1H，d，J=3.9 Hz，Ha-18)，2.96(1H，dd，J=12.1 Hz，Ha-18)，4.35(1H，m，Ha-19)，4.87(1H，d，J=3.9，2.3 Hz，Ha-19)，0.90(3H，s，H-20)，1.94(3H，s，CH3CO)，2.10(3H，s，CH3CO)，3.32(3H，s，OCH3)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：22.2(CH2，C-1)，25.0(CH2，C-2)，39.6(CH2，C-3)，65.1(C，C-4)，45.5(C，C-5)，72.1(CH，C-6)，33.5(CH，C-7)，36.0(CH，C-8)，40.1(C，C-9)，48.3(CH，C-100)，83.3(CH，C-11)，32.1(CH2，C-12)，40.5(CH，C-13)，32.8(CH2，C-14)，104.9(CH，C-150，109.2(CH，C-16)，14.1(CH3，C-17)，48.5(CH2，C-18)，61.8(CH2，C-19)，16.3(CH3，C-20)，170.1(C=O，CH3CO)，21.2(CH3，CH3CO)，170.7(C=O，CH3CO)，21.2(CH3，CH3CO)。以上波譜數據與文獻[11]對照基本一致，故確定化合物4為clerdinin B。

化合物5白色無定型粉末;C26H40O8，ESI-MS：m/z480；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：2.11(1H，m，H-1)，1.59(1H，m，H-1)，1.84(1H，m，H-20)，1.40(1H，m，H-2)，0.97(1H，m，H-3)，2.10(1H，m，H-3)，4.64(1H，dd，J=11.4，4.6 Hz，H-6)，1.42(1H，m，H-7)，1.66(1H，m，H-7)，0.90(1H，s，H-20)，1.42(1H，m，H-8)，1.61(1H，m，H-10)，3.97(1H，dd，J=12.0，4.0 Hz，H-11)，1.73(1H，m，H-12)，1.46(1H，m，H-12)，3.01(1H，m，H-13)，2.19(1H，m，H-14)，1.63(1H，m，H-14)，5.10(1H，d，J=4.8 Hz，H-15)，5.67(1H，d，J=5.4 Hz，H-16)，0.82(3H，s，H-17)，2.95(1H，dd，J=3.6，2.4 Hz，Ha-18)，2.20(1H，d，J=3.6 Hz，Ha-18)，4.37(1H，J=12.0 Hz，Ha-19)，4.85(1H，d，J=12.0 Hz，Ha-190)，0.92(3H，s，H-20)，1.90(3H，s，OCOCH3)，2.37(2H，dq，J=7.6，1.6 Hz，CH3CH2CO)，1.15(3H，t，J=7.6 Hz，CH3CH2CO)，3.30(3H，s，OCH3)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：22.7(CH2，C-1)，24.7(CH2，C-2)，31.9(CH2，C-3)，65.0(C，C-4)，45.4(C，C-5)，70.4(CH，C-6)，33.4(CH，C-7)，36.9(CH，C-8)，40.4(C，C-9)，48.5(CH，C-10)，85.1(CH，C-11)，31.4(CH2，C-12)，39.6(CH，C-13)，35.4(CH2，C-14)，103.6(CH，C-15)，109.4(CH，C-16)，16.4(CH3，C-17)，48.5(CH2，C-18)，62.9(CH2，C-19)，14.9(CH3，C-20)，170.1(C=O，CH3CO)，21.5(CH3，CH3CO)，174.2(C=O，CH3CH2CO)，27.5(CH2，CH3CH2CO)，15.1(CH3，CH3CH2CO)，55.3(CH3，15-OMe)。 以上波譜數據與文獻[12]對照基本一致，故確定化合物5為scutellin A。

化合物6白色粉末;C33H35NO8，ESI-MS：m/z573；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：1.71(1H，m，Ha-1)，2.17(1H，m，Hb-1)，5.73(1H，m，H-2)，5.76(1H，br d，J=9.6 Hz，H-3)，6.41(1H，d，J=10.1 Hz，H-6)，5.92(1H，d，J=10.1 Hz，H-7)，2.36(1H，d，J=12.6 Hz，H-10)，6.41(1H，d，J=17.0 Hz，H-11)，6.44(1H，d，J=17.0 Hz，H-12)，5.94(1H，br s，H-14)，5.00(2H，s，H-16)，1.07(3H，s，H-17)，1.42(3H，s，H-18)，1.29(3H，s，H-19)，1.56(3H，s，H-20)，8.98(1H，br s，H-3′′)，8.63(1H，br d，J=4.6 Hz，H-5′′)，7.25(1H，dd，J=7.8，4.6 Hz，H-6′′)，8.03(1H，d，J=7.8 Hz，H-7′′)，7.86(2H，m，H-3′′′，H-7′′′)，7.34(2H，m，H-4′′′，H-6′′′)，7.49(1H，t，J=7.4 Hz，H-5′′′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：26.2(CH2，C-1)，123.1(CH，C-2)，133.5(CH，C-3)，77.0(C，C-4)，43.4(C，C-5)，75.8(CH，C-6)，76.8(CH，C-7)，77.8(C，C-8)，48.3(C，C-9)，42.8(CH，C-10)，146.6(CH，C-11)，122.0(CH，C-12)，162.0(C，C-13)，115.4(CH，C-14)，174.0(C，C-15)，70.7(CH2，C-16)，20.1(CH3，C-17)，22.6(CH3，C-18)，15.5(CH3，C-19)，17.1(CH3，C-20)，164.7(C，C-1′′)，125.3(C，C-2′′)，150.7(CH，C-3′′)，153.5(CH，C-5′′)，123.3(CH，C-6′′)，136.7(CH，C-7′′)，165.8(C，C-1′′′)，128.4(C，C-2′′′)，129.9(CH，C-3′′′，C-6′′′)，128.4(C，C-4′′′，C-7′′′)，133.4(CH，C-5′′′)。以上波譜數據與文獻[13]對照基本一致，故確定化合物6為scutebarbatine C。

2.2 抗腫瘤活性的測定

本文利用MTT法評估了化合物對HepG2和HepG2/Adr細胞的抗腫瘤活性。結果如表1所示，化合物1～6在20 μM濃度下對HepG2和HepG2/Adr細胞沒有明顯殺傷作用，細胞的存活率均大于80%，即在<20 μM濃度下,該系列化合物也未有明顯的細胞毒性。

圖1 半枝蓮中新克羅烷型二萜化合物的結構Fig.1 Structures of neo-clerodane diterpenoids from S.barbata

表1 化合物對HepG2和HepG2/Adr細胞的細胞活力影響

2.3 逆轉腫瘤多藥耐藥測定

化合物1～6對HepG2/Adr細胞耐藥性的逆轉作用。結果如表2所示，20μM化合物在與阿霉素聯用時，化合物1、2、3、6可以逆轉阿霉素對HepG2/Adr細胞的耐藥性，逆轉倍數(RI)范圍為14.04～39.42，陽性藥物維拉帕米(陽性對照)的逆轉倍數(RI)為87.18。其中，化合物1和3的逆轉作用較為明顯，化合物2和6也表現出一定的逆轉活性。以上結果表明，化合物1、2、3、6具有體外逆轉腫瘤多藥耐藥的作用。

2.4 耐藥株HepG2/Adr細胞中P-糖蛋白的表達

根據報道，P-糖蛋白過表達引起藥物外排是腫瘤細胞產生MDR的最主要機制之一。采用蛋白質印跡法檢測敏感株HepG2和耐藥株HepG2/Adr中P-糖蛋白的表達差異，結果證實，耐藥株HepG2/Adr中P-糖蛋白的表達顯著增加(如圖2)。

表2 HepG2/Adr細胞中阿霉素與化合物聯用的逆轉倍數

圖2 HepG2和HepG2/Adr細胞中MDR1的表達Fig.2 Expression of MDR1 in HepG2 cells and HepG2/Adr cells

2.5 化合物對P-糖蛋白表達的影響

采用蛋白質印跡法，考察半枝蓮新克羅烷型二萜對P-糖蛋白表達的影響。結果顯示：化合物1～6處理HepG2/Adr細胞48 h，無論是單獨給藥還是與阿霉素聯合給藥，對P-糖蛋白的表達都未有明顯的影響(見圖3：A～D)，與對照組沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖3 蛋白質印跡法評估MDR1的表達Fig.3 Western blotting to assess the expression of MDR1注：A和B：半枝蓮新克羅烷型二萜化合物1～6單獨給藥48小時對MDR1表達的影響；C和D：半枝蓮新克羅烷型二萜化合物1～6與阿霉素聯合給藥48 h對MDR1表達的影響。Note:A and B:The effect of neo-clerodane diterpenoids from S.barbata compounds 1-6 on MDR1 expression for 48 hours alone;C and D:The effect of neo-clerodane diterpenoids from S.barbata compounds 1-6 on the expression of MDR1 in combination with Adr for 48 hours.

2.6 細胞內阿霉素積累實驗

采用熒光追蹤實驗研究化合物1～6對阿霉素在細胞內的積累的影響。結果顯示，Adr單獨處理HepG2/Adr細胞，Adr在細胞內積累量極低，當陽性藥物維拉帕米與Adr聯合用藥時，Adr在細胞內的積累量明顯增加。當用化合物1～6與Adr聯合用藥時，Adr在細胞內的積累量同樣出現不同程度的增加，化合物1和3與Adr聯用時，Adr在HepG2/Adr細胞中內積累增加最為明顯，其次為化合物2和6(見圖4：A和B)。

3 討論

圖4 阿霉素在HepG2/Adr細胞中的積累Fig.4 The accumulation of Adr in HepG2/Adr cell注：A：通過熒光顯微鏡觀察阿霉素的積累變化(200×)；B：HepG2/Adr細胞中Adr累積的熒光值(與Adr組比較：*P<0.05，**P<0.01，比例尺=300 μM。Note:A:The accumulation of Adr was measured by fluorescence microscopy;B:Fluorescence values of Adr accumulation in HepG2/Adr cells (Compared with the Adr group:*P<0.05,**P<0.01),scale bar=300 μm.

腫瘤的多藥耐藥是癌癥化療中普遍存在的問題，逆轉癌細胞的多藥耐藥是克服化療藥物抗性和改善化療效果的有效方法[14]。目前的研究發現增加藥物外排的ABC家族轉運蛋白如P-糖蛋白(MDR1/ABCB1)、多藥耐藥相關蛋白(MRP1/ABCC1)和乳腺癌耐藥相關蛋白(BCRP/ABCG2)等在腫瘤細胞產生耐藥性方面發揮作用[15]；此外，多種酶類如蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT或PKB)、整聯蛋白連接激酶(ILK)等[16，17]以及細胞凋亡信號通路抑制，如凋亡相關蛋白Bcl-2過表達以及p53基因突變等也與腫瘤多藥耐藥密切相關[18]。其中，以P-糖蛋白為代表的ABC轉運蛋白超家族所引起的藥物外排是腫瘤細胞產生耐藥性的最重要的原因[19]。P-糖蛋白是一種分子量約為170 kD的跨膜糖蛋白，具有能量依賴性“外排泵”的功能。P-糖蛋白一方面與藥物結合，另一方面通過與ATP結合，ATP供能，使細胞內藥物泵出細胞外，減少了抗癌藥物在細胞內的積累使細胞產生耐藥性[20]。因此，抑制P糖蛋白的表達或者干擾P-糖蛋白的外排功能均能有效的逆轉腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性[21]。本文從半枝蓮中分離鑒定了6個新克羅烷型二萜：scutebarbatine Y(1)、scutebarbatine B(2)、suctebartine F(3)、clerdinin B(4)、scutellin A(5)、scutehennanine D(6)(如圖1)。其中，化合物4為首次從半枝蓮中分離獲得。體外逆轉腫瘤多藥耐藥活性研究發現，化合物1、2、3和6均顯示出可以逆轉耐藥細胞HepG2/Adr對Adr的耐藥性；蛋白免疫印跡實驗結果顯示，在HepG2/Adr細胞中，P-糖蛋白的表達明顯升高，這可能是其產生耐藥性的主要原因。然而實驗發現幾種半枝蓮新克羅烷型二萜并不影響P-糖蛋白的表達，進一步我們通過熒光實驗發現，化合物確實能夠促進阿霉素在耐藥細胞中的積累，減少藥物的外排，即干擾了P-糖蛋白對Adr的外排作用。因此，幾種化合物極可能是通過作為競爭性底物或干擾ATP功能抑制P-糖蛋白的外排功能來實現逆轉腫瘤多藥耐藥的。