淫羊藿總黃酮促進成骨分化的類雌激素作用

林思文，諶少波，殷嫦嫦，邵銀初*

1中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇八醫院，南昌330001；2九江學院，九江 332000

骨質疏松癥常見于絕經后婦女，目前學術上普遍觀點認為：絕經后婦女雌激素水平逐漸下降，成骨細胞增生減弱，破骨細胞過度活躍，造成全身性骨量減少、骨組織顯微結構破壞，從而顯著增加了骨折的風險，影響生存質量。因此，研究如何延緩絕經后婦女骨質疏松癥的發展進程，漸漸成為了老年醫學領域的一個熱門話題。淫羊藿(Epimedii Folium)作為一味祖國傳統中藥，自古以來為補腎陽、強筋骨、祛風濕之要藥。其中，淫羊藿總黃酮(total flavonoids of Epimedii Folium，EF)為從淫羊藿植株中提取的黃酮類化合物，我們的前期研究發現EF具有促進大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化的作用[1]。此次試驗旨在研究EF促進BMSCs向成骨細胞分化是否與雌激素受體(estrogen receptor，ER)有關，從而確定其是否具有類雌激素作用，對于探討激素替代療法治療絕經后骨質疏松癥有積極意義。

1 材料與試劑

1.1 細胞

購自江陰齊氏生物科技有限公司第1代hBMSCs。

1.2 主要試劑及耗材

EF(九江學院藥學院提供，純度>95%，用DMSO配置成40 mg/mL的儲存液于4 ℃備用)；ICI182780(Selleck公司)；DMSO、瓊脂糖、TAE、PBS粉、青鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司)；胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶-EDTA(美國Gibco公司)；α-MEM培養基(美國Hyclone公司)；茜素紅粉(西隴化工股份有限公司)；GREENspin組織/細胞RNA提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)；Hi Fi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；2×Taq Master Mix、DNA Marker：(北京近岸科技有限公司)；基因引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；三氣細胞培養箱(德國Eppendorf公司)；TS100-F 倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；FACS Calibur流式細胞儀(BD公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；凝膠成像系統(美國SIM公司)；冷凍高速離心機(珠海黑馬醫學儀器有限公司)；Mini水平電泳槽(美國BIO-RAD公司)；PCR儀(杭州博日科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 hBMSCs的培養、傳代及細胞形態學觀察

將購自江陰齊氏生物科技有限公司的含第1代hBMSCs的培養瓶吸棄多余培養基后，置于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養，待貼壁細胞融合達80～90%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細胞，PBS洗滌細胞后加入適量完全培養基(含1%雙抗及10%FBS的α-MEM培養基)充分吹打混勻，以1∶2分裝于兩個培養瓶中，繼續置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，以此方法繼續傳代，細胞逐漸純化。待細胞量滿意后可用含10%FBS的DMSO凍存液凍存部分細胞備用。用倒置相差顯微鏡觀察各代細胞不同時間的細胞形態。

2.2 流式細胞儀鑒定hBMSCs

取第4代hBMSCs進行細胞鑒定。待第4代hBMSCs貼壁融合達80%～90%時，以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，離心(1000 rpm，5 min)后棄上清，用含10%FBS的PBS離心洗滌細胞兩遍，再用含10%FBS的PBS重懸細胞，調整細胞數至1×106/mL，以每管80 μL分裝至4個1.5 mL EP管中，分別加入FITC標記的抗人CD90和CD45單抗，并設置同型對照組(含FITC標記的抗HLA-DR單抗)、空白對照組，室溫避光30 min后以含10%FBS的PBS離心洗滌細胞兩遍，最后每管加入500 μL PBS充分重懸，2 h內上流式細胞儀檢測。

2.3 CCK-8法檢測EF對hBMSCs增殖的影響

取第4～6代hBMSCs，待細胞貼壁融合達80%～90%后，以0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細胞，PBS離心洗滌兩次后，加入培養基(含10%FBS的α-MEM)將細胞充分重懸并計數。調整細胞數至1×104/mL，以每孔200 μL接種于96孔板中，置入37 ℃、5%CO2培養箱中孵育24 h，棄去培養基，分別加入含不同濃度(0、2.5、5、10、20、40 μg/mL)EF(以事先配置好的儲存液加入空白培養基配置含40 μg/mL EF的含0.1%DMSO培養基，再與含0.1%DMSO不含藥物培養基不同比例混合配置成目標濃度)、均含0.1%DMSO的培養基，每孔200 μL。每個濃度設置4個復孔及1個不含細胞的對照孔。分別在第12、24、48、72 h每孔加入10μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后上酶標儀在450 nm光波長檢測各孔吸光度A。計算各濃度吸光度OD=A藥物-A對照，并繪制成圖表。

2.4 EF促進hBMSCs成骨分化的細胞形態觀察

取第4～6代hBMSCs消化后按105/mL接種于細胞數六孔板中，24 h后，更換加有10 μg/mL EF的含10%FBS的α-MEM培養基(含0.1%DMSO)，并設置空白對照組(含10%FBS的α-MEM培養基，含0.1%DMSO)，每3天換液一次，誘導14天，定期利用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。

2.5 茜素紅染色

取第4～6代hBMSCs消化后按105/mL接種于細胞數六孔板中，24 h后，按以下分組更換培養基：對照組(含10%FBS的α-MEM培養基)、EF組(添加20 μg/mL EF的含10%FBSα-MEM培養基)、EF+ICI182780組(添加10 μg/mL EF及1 μmol/L ICI182780的含10%FBSα-MEM培養基)，每3天換液一次，誘導14天。棄去培養基，PBS清洗2次，95%乙醇固定10min，三蒸水洗2遍，0.1%茜素紅(pH8.3)于37 ℃下反應30 min，PBS沖洗兩遍后置于倒置相差顯微鏡下觀察。

2.6 RT-PCR檢測OPN、ALP基因的表達

按以上分組作用于細胞，誘導14天后消化并收集細胞，按RNA提取試劑盒說明提取細胞RNA，按逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，加入上下游引物(序列見表1)及Taq擴增，將產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳后在凝膠成像系統紫外燈下拍照。并用Image J軟件分析條帶灰度。

表1 基因引物序列

2.7 統計學處理

3 結果

3.1 hBMSCs培養、傳代及細胞形態學觀察

傳代細胞中，單個細胞呈梭形、多角形貼壁生長，有形態不同的突起，相互之間無規律生長(見圖1-1)；隨著細胞數量的增多，細胞逐漸匯合，突起逐漸消失，細胞排列逐漸規律，呈成纖維細胞樣(見圖1-2、圖1-3)；8～9天后，細胞逐漸鋪滿瓶底，細胞之間連接緊密，呈旋渦狀、魚群樣貼壁生長(見圖1～4)。

3.2 流式細胞儀檢測細胞表面抗原

經傳代后的hBMSCs經流式細胞儀鑒定，骨髓間充質干細胞標志CD90表達呈陽性(陽性率92.36%)，而造血干細胞標志CD45表達呈陰性(95.40%)，結果表明細胞均一性良好(圖2)。

3.3 EF對hBMSCs增殖的影響

不同濃度EF作用于hBMSCs后，對hBMSCs的增殖作用存在不同：高濃度組(10、20、40 μg/mL組)對細胞增殖均有不同程度的抑制作用，并且濃度越高、抑制作用越明顯；而低濃度組(2.5和5 μg/mL組)反而對細胞增殖存在一定程度的促進作用(圖3)。我們選用對細胞有輕微抑制作用的10 μg/mL進行細胞誘導實驗。

圖1 P3代hBMSCs細胞形態觀察(10×10)Fig.1 Morphological observation of P3 generation hBMSCs (10×10)注：1.培養第3天；2.培養第5天；3.培養第7天；4.培養第9天。Note:1.3 days of culture;2.5 days of culture;3.7 days of culture;4.9 days of culture.

圖2 細胞表面CD90、CD45表達情況Fig.2 Expression of CD90,CD45 on cell surface

圖3 不同濃度EF作用hBMSCs不同時間的細胞吸光度值ODFig.3 Cell absorbance OD of hBMSCs exposed to different concentrations of EF at different time

3.4 EF促進hBMSCs成骨分化的細胞形態觀察

EF作用于hBMSCs 后，3～7天內，細胞形態逐漸由長梭形向立方形或多邊形轉變；7天后隨著細胞的增殖，細胞開始重疊，相互聚集成團并逐漸開始形成散在的細胞結節，細胞周圍形成沉積的鈣鹽，成團狀或條索狀；14天后，細胞聚集成典型的骨小節結構，為大小不等的不規則形，正常的原有細胞形態消失(圖4)。

圖4 EF作用hBMSCs的細胞形態觀察Fig.4 Morphological observation of hBMSCs induced by EF注：1.誘導第3天(10×10)；2.誘導第7天(10×10)；3.誘導第14天(10×10)；4.誘導第14天(10×40)。Note:1.3rd day (10 × 10);2.7th day (10 × 10) ;3.14th day (10 × 10);4.14th day (10 × 40).

3.5 鈣結節的茜素紅染色表現

茜素紅能將鈣結節染成紅色。實驗結果表明：與對照組相比，EF能促進細胞形成大量的鈣結節(圖5-1和5-2)，而當在有雌激素受體阻滯劑ICI182780存在的情況下，EF的這種促進細胞形成鈣結節的能力明顯受抑制(圖5-3)。

圖5 茜素紅染色后鏡下觀(10×10)Fig.5 Alizarin red staining under microscope (10 × 10)注：1.對照組；2.EF組；3.EF+ICI182780組。Note:1.Control group;2.EF group;3.EF+ICI182780 group.

3.6 成骨相關基因OPN、ALP的表達

通過檢測OPN、ALP基因的表達情況表明：與對照組相比，EF能明顯上調OPN、ALP基因的表達(P<0.05)，而在EF加入ICI182780 以后，OPN、ALP基因的表達均明顯下降(P<0.05)(圖6)。

圖6 OPN、ALP mRNA的表達結果Fig.6 The expression of OPN,ALP mRNA注：1.對照組；2.EF組；3.EF+ICI182780組。與對照組比較，*P<0.05；與EF組比較，#P<0.05。Note:1.Control group;2.EF group;3.EF+ICI182780 group.Compared with control group,*P < 0.05;Compared with EF group,#P < 0.05.

4 討論

黃酮類化合物的類雌激素作用已在很多實驗中得到證實[2-5]。利用黃酮類化合物的這一特征，學者們逐漸將其與治療絕經后骨質疏松癥聯系起來[6，7]，我們選用EF對hBMSCs進行誘導，來闡述這一發現。

實驗首先使用不同濃度EF作用于細胞，探尋最合適的EF誘導濃度。本研究發現，較高濃度的EF作用于BMSCs主要表現為細胞毒作用，這可能與濃度高的EF增加細胞外滲透壓使細胞脫水死亡有關，而低濃度的EF細胞毒作用不明顯，甚至有促進其增殖的作用。針對增殖和分化在一定程度上互相抑制的特點，我們選用輕度抑制hBMSCs增殖的EF濃度(即10 μg/mL)進行誘導成骨分化實驗。為了驗證EF的類雌激素作用，實驗設置了EF+ICI182780組，ICI182780作為ER的特異性抑制劑，可以抑制ER受體被激活產生的一系列生物學效用，本實驗從細胞形態、鈣結節染色、基因表達等多方面進行了結果的闡述。較高濃度的鈣、磷、鎂沉積并附著于成骨細胞胞漿內的線粒體嵴表面，茜素紅可與其中的鈣離子螯合，產生深紅色或紫紅色復合物，根據著色情況可以判斷鈣鹽沉積(鈣結節)的狀況，從而一定程度上知道各實驗組成骨分化的效率。從本實驗結果可以看出，EF能有效地促進hBMSCs向成骨樣細胞分化并使產生明顯礦化鈣結節，在添加ICI182780后，這種現象明顯受抑制。OPN(骨橋蛋白，osteopontin)與ALP(堿性磷酸酶，alkaline phosphatase)均在骨組織中呈現高表達[8，9]，成骨細胞漿內富含大量的OPN和ALP，血液中OPN和ALP的濃度可以反映成骨細胞活性。本實驗結果表明，EF能上調OPN、ALP基因的表達，而ICI182780卻能抑制EF的這種上調作用。以上實驗結果初步表明：EF具有通過上調ER的表達從而促進hBMSCs向成骨分化的作用。這為EF誘導hBMSCs成骨分化的類雌激素所用提供了一個良好的依據。

當然，基于本實驗的結果，有后續更為廣闊的空間供我們思考。為更好地驗證EF的類雌激素作用，實驗可以增加雌激素組作為對照，也可以將ER細分到ERα和ERβ兩個亞型上進行進一步的研究；甚至后期可以嘗試尋找一條相關的下游信號通路，研究具體的分子機制。