黨參藥材活性成分黨參炔苷的化學(xué)穩(wěn)定性研究

廖江敏，李林玉，瞿云安，楊雪峰，楊軍宣*

1重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016；2成都晶富醫(yī)藥科技有限公司，成都 610041

黨參屬于我國傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，其味甘、性平、歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，黨參能夠調(diào)節(jié)血糖、提高造血機(jī)能、抗疲勞、抗應(yīng)激、抗缺氧、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、保護(hù)胃腸道黏膜、調(diào)節(jié)胃收縮功能、抗?jié)兊萚1]。黨參的主要成分有糖類、苷類、萜類、生物堿類及聚炔類等，其主要活性成分黨參炔苷屬于聚乙炔類化合物，由于含有共軛三鍵，因而具有不飽和性和活潑性,易發(fā)生加成、氧化等反應(yīng)，但黨參炔苷又帶有醇官能團(tuán)，使其三鍵變得相對(duì)穩(wěn)定[2,3]。2015年版中國藥典中收載黨參來源為桔?？浦参稂h參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.、素花黨參C.pilosulaNannf.var.modesta(Nannf.) L.T.Shen 或川黨參C.tangshenOliv.的干燥根，藥材質(zhì)量控制僅收載了薄層色譜的定性鑒別方法，尚未收載黨參炔苷等活性成分的定量檢測(cè)方法[4]。而目前亦缺乏黨參炔苷穩(wěn)定性的深入研究。本研究采用HPLC方法，測(cè)定黨參炔苷對(duì)照品及黨參提取液經(jīng)不同條件(溫度、受熱時(shí)間、光照強(qiáng)度、pH)處理后的黨參炔苷含量變化，考察各種因素對(duì)黨參炔苷化學(xué)穩(wěn)定性的影響，為藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、藥材炮制加工及中成藥生產(chǎn)等提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent-1200型高效液相色譜儀(安捷倫公司)；LS-220A電子天平(瑞士Precisa公司)，ES225SM-DR雙量稱天平(瑞士Precisa公司)；Q/BKYY31-2000電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；ULUP-IV-20T優(yōu)普系列超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

黨參炔苷(購于四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)為wkq18072501，純度為HPLC≥98%)；黨參藥材自采于重慶市巫山縣，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院何先元教授鑒定為《中國藥典》2015年版一部川黨參CodonopsistangshenOliv.的干燥根；乙腈和甲醇為色譜純，水為雙蒸水。

1.2 黨參炔苷HPLC測(cè)定方法建立

采用HPLC方法測(cè)定黨參炔苷含量[5]，并參考文獻(xiàn)進(jìn)行了方法學(xué)考察[4,6]。

1.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱為SinoChrom ODS-BP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(25∶75)；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為267 nm；進(jìn)樣體積為10 μL；柱溫為30 ℃；按黨參炔苷峰計(jì)算理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2 000。

1.2.2 方法學(xué)考察

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精確稱取黨參炔苷對(duì)照品5.08 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備

取黨參藥材適量，稱定重量，加入8倍量水，煎煮2次，每次1小時(shí)，合并煎液，濃縮至1∶1(g/mL)，放冷，加入乙醇至含醇量為50%，靜置過夜，過濾，濾液回收乙醇，濃縮至1∶1(g/mL)，即得樣品溶液。精確量取樣品溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

圖1 對(duì)照品溶液(A)、供試品溶液(B)及陰性對(duì)照(C)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard solution(A),sample solution(B) and blank control(C)

1.2.2.3 專屬性考察

取黨參炔苷對(duì)照品溶液、黨參藥材提取液制備的供試品溶液及空白溶劑按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見圖1，表明陰性無干擾。

1.2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液2、4、8、10、15、20 μL進(jìn)樣，每個(gè)體積分別重復(fù)進(jìn)樣3次，以進(jìn)樣量(μg)為X軸，峰面積值A(chǔ)為Y軸來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到回歸方程為Y=539 847X+ 8 090.8，r=0.9993，表明黨參炔苷進(jìn)樣量在0.101 6～1.016 0 μg范圍時(shí)，進(jìn)樣量與峰面積值有良好的線性關(guān)系。

1.2.2.5 精密度試驗(yàn)

取同一份黨參炔苷對(duì)照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值為0.43%，表明儀器精密度良好。

1.2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“1.2.2.2”方法制備供試品溶液，室溫下放置，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD值為0.62%。

1.2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按“1.2.2.2”方法平行制備6份供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算RSD值為0.89%。

1.2.2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

采用加樣回收法，精確量取““1.2.2.2””項(xiàng)下提取濃縮后的樣品溶液1 mL，共9份，分成3組，每組3份，分別加入0.8、1.0、1.2倍的黨參炔苷對(duì)照品，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算黨參炔苷含量，按下式計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均加樣回收率為100.04%，RSD=1.26%。

1.3 黨參炔苷的穩(wěn)定性考察

1.3.1 溫度的影響

精密稱取適量黨參炔苷對(duì)照品，置25 mL容量瓶中，加塞密閉，共5份；另取黨參藥材提取樣品溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，加塞密閉，共5份。取供試品分別置50、60、70、80、90 ℃的恒溫水浴鍋中，加熱5 h，放冷后，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得黨參炔苷單體的供試液及黨參藥材提取制備的供試液。按“1.2.1”色譜條件測(cè)定，按下式計(jì)算黨參炔苷的相對(duì)含量(RC)，考察黨參炔苷隨溫度的變化情況。

RC=(Ci/C0)×100%

式中Ci：每一檢測(cè)點(diǎn)樣品測(cè)定的含量，μg/mL；C0：每一樣品的初始含量，μg/mL。

1.3.2 受熱時(shí)間的影響

同“1.3.1”方法，分別取黨參炔苷對(duì)照品及黨參藥材提取液樣品適量，按“1.3.1”篩選所得的敏感溫度條件下分別加熱1、2、3、4、5 h，制備供試液后，按“1.2.1”色譜條件測(cè)定，計(jì)算相對(duì)含量(RC)，考察黨參炔苷隨加熱時(shí)間的變化情況。

1.3.3 光照的影響

同“1.3.1”方法，分別取黨參炔苷對(duì)照品及黨參藥材提取液樣品適量，分別在避光條件下及強(qiáng)光照(80 Klx)條件下放置12、24、36、48、72 h，分別制備供試液。按“1.2.1”色譜條件測(cè)定，計(jì)算相對(duì)含量(RC)，考察黨參炔苷隨光照的變化情況。

1.3.4 pH值的影響

同“1.3.1”方法，分別取黨參炔苷對(duì)照品及黨參藥材提取液樣品適量，分別用pH值為2、7、10、12的PBS液溶解并稀釋至刻度，于60 ℃水浴6 h，放冷，補(bǔ)足減失的溶劑，得到供試液。按“1.2.1”色譜條件測(cè)定，計(jì)算相對(duì)含量(RC)，考察黨參炔苷隨pH值的變化情況。

2 結(jié)果

2.1 溫度的影響

按“1.3.1”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并檢測(cè)，結(jié)果見圖2。

圖2 黨參炔苷含量隨溫度變化圖Fig.2 Diagram of lobetyolin content changing with temperature注：S:Standard solution；E:Extracting solution，下同。

結(jié)果表明，黨參炔苷在60 ℃的溫度下加熱5 h含量無明顯變化；超過60 ℃加熱時(shí)含量發(fā)生明顯變化，70 ℃加熱5 h后，含量下降約26%，80 ℃加熱5 h，含量下降約49%，90 ℃加熱5 h，含量下降約75%，溫度對(duì)黨參炔苷含量有顯著影響(P<0.05)。黨參藥材提取液90 ℃加熱5 h，黨參炔苷含量下降約59%，變化不如對(duì)照品單體明顯。

2.2 受熱時(shí)間的影響

按“1.3.2”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并檢測(cè)，結(jié)果見圖3。

圖3 黨參炔苷含量隨受熱時(shí)間變化圖Fig.3 Diagram of lobetyolin content changing with heating time

結(jié)果表明，隨加熱時(shí)間的增加，黨參炔苷單體及黨參藥材提取液中的含量呈持續(xù)降低趨勢(shì)，相同條件下黨參藥材提取液中黨參炔苷含量的變化不如對(duì)照品單體明顯。

2.3 光照的影響

按“1.3.3”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并檢測(cè)，結(jié)果見圖4。

圖4 黨參炔苷含量隨光照時(shí)間變化圖Fig.4 Diagram of lobetyolin content changing with irradiation time

結(jié)果表明，光照對(duì)黨參炔苷含量有顯著影響(P<0.05)。避光條件下，黨參炔苷單體及黨參藥材提取液含量3天內(nèi)無明顯改變；80 KLx照射3天，黨參炔苷對(duì)照品含量降低約60%，黨參藥材提取液中黨參炔苷含量降低約50%。

2.4 pH值的影響

按“1.3.4”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并檢測(cè)，結(jié)果見圖5。

圖5 黨參炔苷含量隨pH值變化圖Fig.5 Diagram of lobetyolin content changing with pH

結(jié)果表明，黨參炔苷在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同酸堿度溶液中穩(wěn)定性良好，但pH>12時(shí)，含量有逐漸降低趨勢(shì)。

3 討論與結(jié)論

黨參作為傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，應(yīng)用廣泛。本研究表明，黨參藥材的主要活性成分黨參炔苷無論是單體溶液還是在提取液中，對(duì)溫度及光照均較敏感，60 ℃以下黨參炔苷穩(wěn)定性良好，超過60 ℃條件下含量隨溫度的升高及受熱時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低(P<0.05)，提示在黨參藥材加工處理、飲片炮制及中成藥生產(chǎn)等過程中溫度應(yīng)控制在60 ℃以下，且不宜長(zhǎng)時(shí)間受熱處理；同時(shí)，光照對(duì)黨參炔苷含量有顯著影響(P<0.05)，避光條件下利于黨參活性成分的保存；此外，黨參炔苷在不同酸堿度溶液中的穩(wěn)定性良好，但pH值偏高(≥12)時(shí)，含量逐漸降低。

通過對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，上述相同條件下黨參藥材提取液中黨參炔苷含量的變化不如對(duì)照品單體明顯，表明黨參藥材中的某些成分可以提高黨參炔苷的穩(wěn)定性，其保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)在相同處理?xiàng)l件下，黨參炔苷溶液狀態(tài)及固態(tài)的含量變化不一致，具體變化規(guī)律及其機(jī)制有待進(jìn)一步研究；不同光照強(qiáng)度的不同照射時(shí)間及不同pH條件下更長(zhǎng)處理時(shí)間對(duì)黨參炔苷穩(wěn)定性的影響有待進(jìn)一步研究；同時(shí)，上述條件下黨參炔苷的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)亟待進(jìn)一步深入研究，以便考察其半衰期并預(yù)測(cè)有效期，為藥材質(zhì)量控制提供參考和依據(jù)。