油茶蒲多糖的提取工藝優化及其抗氧化活性

李佳佳，羅思源，丁春邦，陳 濤，周莉君

(四川農業大學生命科學學院，四川 雅安 625014)

油茶(Camelliaoleifera)屬山茶科山茶屬植物，是我國特有的油料樹種，具有悠久的種植歷史，也是世界四大木本食用油料作物之一，主要利用其茶籽榨取茶油[1].茶油中含有豐富的不飽和脂肪酸和多種酚類化合物，營養價值豐富[2-3].由于其具有良好的抗氧化、防紫外輻射、免疫調節、降血糖等多種活性，被譽為“東方橄欖油”[4-5].

近年來，國家大力推進油茶產業的發展，經國務院批準頒布了全國茶油產業發展規劃，規劃提出，到2020年，全國油茶產量將達到250萬t[6].但提取油脂后的副產物也隨之增多，油茶蒲便是其主要的一個副產物.油茶蒲即油茶果殼，占油茶果濕重的60%以上，在油茶產業中常作為燃料或直接作為廢棄物處理，未被有效利用.研究表明，油茶蒲中含有酚類、萜類、黃酮以及多糖等多種物質[7-9]，其提取物已被證實具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂以及減肥等功效[10-12].據報道，油茶蒲多酚對人體細胞DNA損傷有顯著的保護作用[13]，其黃酮及皂苷類物質具有較好的抑菌作用[14-15]，但關于其多糖的活性卻鮮有報道.目前關于油茶蒲多糖的研究主要集中在提取方面，且提取率相對較低[16].為了提高資源綜合利用率，對油茶蒲多糖的提取工藝進行優化并探究其活性顯得十分必要.

因此本實驗以油茶果蒲為材料，對熱水提取法提取油茶蒲多糖的工藝進行了優化，并探討其體外抗氧化活性，旨在為保護環境、進一步提高油茶資源利用率提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶蒲：四川省榮縣油茶基地提供，經四川農業大學生命科學學院丁春邦教授鑒定.

無水乙醇、石油醚、苯酚、硫酸、葡萄糖、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、PBS(磷酸緩沖液)、鐵氰化鉀、TCA(三氯乙酸)、三氯化鐵、H2O2、水楊酸、硫酸亞鐵、抗壞血酸均購自成都科龍試劑廠，所有試劑均為分析純.

1.2 儀器與設備

電子天平(BT-124S)：德國Sartorius公司；實驗室超純水機(RM-220)：四川沃特爾科技發展有限公司；臺式冷凍離心機(Allegra X-15R)：貝克曼庫爾特有限公司；高速冷凍離心機：美國Thermo Fisher公司；旋轉蒸發儀(RE-2000B)：上海亞榮生化儀器廠；酶標儀(Specra Max M2)：美國Molecular Devices公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 材料預處理 將油茶蒲放于60 ℃恒溫烘箱干燥4 d后，用粉碎機粉碎并過40目篩.將油茶蒲粉末放于索式提取儀中經石油醚(60～90 ℃)回流8 h脫脂后干燥備用.

1.3.2 油茶蒲多糖的提取與測定 稱取預處理后油茶蒲粉末，按一定液料比加入蒸餾水，在相應溫度下提取一定時間后6 000 r·min-1下離心10 min.采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準品測定上清液多糖含量[17]，計算提取率.合并上清液，旋轉蒸發濃縮，加入3 倍體積無水乙醇過夜沉淀，后離心取沉淀，冷凍干燥得粗多糖.計算公式為：

(1)

式中，C為樣品多糖濃度μgmL-1；N為稀釋倍數；V為樣品體積，單位為mL；m為油茶蒲粉末質量(g).

1.3.3 單因素實驗

1) 提取時間對多糖提取率的影響

2) 提取溫度對多糖提取率的影響

3) 液料比對多糖提取率的影響

1.3.4 響應面實驗設計 以單因素試驗為基礎，選取提取過程中對得率影響較大的變量因素最佳范圍，采用中心組合試驗法，設計液料比A(mLg-1)、提取溫度B(℃)、提取時間C(min)為3個變量因素3水平的試驗，每組試驗重復4次，以茶蒲多糖提取率為響應值(Y)進行實驗，實驗設計如表1.應用Box-Behnken軟件對響應面實驗結果進行分析.

表1 響應面分析因素與水平Tab.1 Response surface analysis factors and levels

1.3.5 油茶蒲多糖體外抗氧化活性測定

1) DPPH自由基清除率測定

根據徐洲[18]等人的方法，略作修改測定油茶蒲多糖的DPPH自由基清除能力.取一定量的油茶蒲粗多糖用蒸餾水溶解為2.0 mgmL-1的母液，并稀釋為0～2.0 mgmL-1相應濃度.取30 μL油茶蒲多糖溶液加入170 μL DPPH(0.4 mmol·L-1)乙醇溶液于96孔板中，黑暗處反應10 min，測定517 nm吸光值，計算DPPH自由基清除率，公式如下(陽性對照為Vc)：

DPPH自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100,

(2)

式中,A1為樣品吸光值，A0為蒸餾水代替樣品的吸光值.

2) 總還原能力測定

根據李粉玲[19]等人的方法，略作修改測定油茶蒲多糖的總還原能力.取0.2 mL多糖溶液，加入0.5 mL PBS(0.2 mmol·L-1)和0.5 mL鐵氰化鉀(1%，m/V)，混勻，于50 ℃水浴鍋中孵化20 min.加入0.5 mL TCA (10%，m/V)后迅速冷卻5 min，取0.5 mL 上層清夜加入0.5 mL蒸餾水和0.1 mL FeCl3(0.1%，m/V)混勻，在700 nm處測定吸光值，以多糖濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制總還原能力圖.以Vc做陽性對照.

1.3.6 數據處理 所有實驗組均重復4次，以平均值±標準誤差表示(Mean±SD)，采用Graphpad Prism 6.0對數據進行統計分析并作圖.

2 實驗結果與討論

2.1 葡萄糖標準曲線

經由苯酚—硫酸法繪制葡萄糖標準曲線(圖1)，其回歸方程為：y=0.008477x+0.1027；R2=0.991.

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 提取時間對多糖提取率的影響 由圖2可以看出，多糖提取率在60 min到120 min內呈逐漸上升趨勢，并在提取時間為120 min時達到最高值，之后略有下降后趨于平緩.表明在一定范圍內增加提取時間可以提高多糖的提取率，但提取時間達到150 min后，多糖提取率相對降低，可能是由于時間過長，多糖結構被破壞而影響提取率[20].因此，結合多糖提取率以及省時的考慮，選擇提取時間120 min為中心點進行響應面優化.

圖2 提取時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides

2.2.2 提取溫度對多糖提取率的影響 由圖3可知，在提取溫度為60 ℃到80 ℃之間時，多糖提取率逐漸增加，在80 ℃以后多糖提取率略有下降.表明適當的熱處理對提取效率起著正面的作用，較高的溫度可以提高多糖的產量，但過高的溫度會導致多糖水解[21].結合該提取結果以及節能的考慮，確定80 ℃為響應面中心點進行響應面優化.

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

2.2.3 液料比對多糖提取率的影響 由圖4可知，在液料比10 mL·g-1到30 mL·g-1條件下，多糖提取率沒有明顯變化，但當液料比大于30 mL·g-1后多糖提取率顯著下降.可見當液料比低于30 mL·g-1時，多糖的提取率受影響較小.當液料比大于30 mL·g-1時提取率降低，有可能是因為溶劑過多，在一定的加熱時間內，溶劑溫度上升速度減慢，多糖未被充分浸出[22].因此，結合實驗結果分析，確定30 mL·g-1作為中心點進行響應面優化.

圖4 液料比對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.3 響應面優化多糖提取

2.3.1 響應面設計結果 Box-Behnken試驗設計及結果如表2所示.

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Tab.2 Box-Behnken test design and results

2.3.2 回歸模型建立及方差分析 利用 Design-Expert 10軟件對表2的結果進行多元回歸擬合分析，得到擬合全變量二次回歸方程：Y=10.39+0.66A+0.63B+0.12C+0.10AB+0.37AC-0.38BC-0.76A2-0.68B2-0.69C2.

2.3.3 響應面分析 采用Design Expert 10軟件對實驗數據進行可視化分析，并作出三維圖和等高線圖.利用三維響應面圖形直觀地展示回歸方程，可以更深入地理解每個被測變量與響應之間的關系，以及任意兩個變量之間的相互作用.二維等高線圖可顯示變量間的相互作用是否顯著.橢圓等高線圖表示變量之間的相互作用是顯著的.相反，圓形等高線圖表示變量間相互作用可以忽略不計.如圖5與圖7中等高線變化較為稀疏，而圖6中等高線變化相對密集，說明提取時間與液料比的交互作用對多糖的提取率影響較大.

通過分析確定出最佳提取工藝條件為：提取時間150 min，提取溫度為84.83 ℃，液料比為32.2 mLg-1，此時油茶蒲多糖得率理論值10.52%.為方便試驗的實際操作，將最佳提取條件調整為液料比為32 mLg-1，提取時間150 min，提取溫度為85 ℃，進行4次平行驗證試驗，在此條件下油茶蒲多糖的得率平均值為10.49 ± 0.21%.結果表明，經過響應面回歸方程擬合出的理論值與實際值相差不大，與理論值符合，驗證了方程的可靠性.且提取率相較于陳景斯[23]等人的乙醇提取工藝，增加了近一倍.

表3 方差分析結果Tab.3 Analysis of variance results

2.4 體外抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 從圖8中可見，油茶蒲多糖對DPPH自由基清除率最高為90 %，與Vc陽性對照相比，在0.5 mgmL-1濃度下，Vc對DPPH的清除率強于油茶蒲多糖，但當油茶蒲多糖濃度大于0.5 mgmL-1時，對DPPH自由基的清除率接近Vc對DPPH自由基的清除率.本次實驗結果表明油茶蒲多糖也具有較強的DPPH自由基清除能力.

圖5 提取時間和溫度對多糖得率交互作用的3D響應面(a)和等高線(b)Fig.5 3D response surface (a) and contour line (b) of interaction between extraction time and temperature to polysaccharide yield

圖6 提取時間和料液比對多糖得率交互作用的3D響應面(a)和等高線(b)Fig.6 3D response surface (a) and contour line (b) of interaction between extraction time and ratio of liquid-feed to polysaccharide yield

圖7 提取溫度和料液比對多糖得率交互作用的3D響應面(a)和等高線(b)Fig.7 3D response surface (a) and contour line (b) of interaction between extraction temperature and ratio of liquid-feed to polysaccharide yield

圖8 多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.8 The scavenging effect of polysaccharide from Camellia oleifera fruit shells on DPPH radical

2.4.2 總還原能力 從圖中可以看出，隨著油茶蒲多糖濃度的增加，其吸光值也隨之增加.研究表明還原能力與抗氧化活性之間有密切關系[24].當濃度達到1.4 mg·mL-1時，在700 nm處吸光值高于1.3，與同濃度的Vc吸光值相近.顯示出油茶蒲多糖通過自身的還原作用給出電子的能力(即還原力)較大，具有較強的抗氧化活性.并且隨著多糖濃度的增加，其還原能力增強，符合濃度劑量效應.

圖9 多糖的總還原能力Fig.9 The total reductive ability of polysaccharide from Camellia oleifera fruit shells

3 結論

本實驗采用熱水浸提法提取油茶蒲多糖，采用苯酚-硫酸法來測定多糖含量，具有操作簡便、結果準確的優點.采用響應面法對油茶蒲多糖提取條件進行優化，以油茶蒲多糖含量為響應值，料液比、提取溫度和提取時間為考察因素，建立二次回歸模型，并采用Design-Expert軟件進行數據處理分析.最終得出油茶蒲多糖的最優提取條件為液料比為32 mL·g-1，提取時間150 min，提取溫度為85 ℃，油茶蒲多糖最高提取率可達到10.49±0.21%.經四次重復驗證，該工藝合理，穩定可靠.體外抗氧化結果表明油茶蒲多糖能夠較好的清除DPPH自由基，具有較強的總還原能力.本實驗結果為油茶蒲多糖的進一步研究和開發提供了理論基礎.